BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC
TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN
AMAURODERMA SUBRESINOSUM

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110113

: TRẦN LÊ VIỆT HÀ
Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP




LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được cuốn đồ án một cách tốt đẹp, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ từ quý thầy cô, gia đình cũng như bạn bè.
Em xin gửi lời cảm ơn và lời chúc sức khỏe đến ban lãnh đạo trường Đại học
Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm
– Môi trường đã truyền đạt cho em những kiến thức về chuyên ngành trong suốt quá
trình học tập tại trường, giúp cho em nắm vững lý thuyết cũng như thực hành.
Em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Hoàng Dũng đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án cũng như lúc viết bài báo cáo, để hôm nay
em có thể hoàn thành bài báo cáo tốt nhất của mình.
Và em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn cùng làm việc tại
phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành công việc một cách tốt nhất.
Con vô cùng cảm ơn ba mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên con
trong suốt quá trình học tập. Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 11DSH04 đã hỗ trợ, chia sẻ
việc học tập trong thời gian 4 năm Đại học.


MỤC LỤC
MỤC LỤC ......................................................................................................................... i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài.................................................................................... 1



Khái quát chung ............................................................................................ 5

1.1.2

Đặc điểm sinh học......................................................................................... 6

1.1.3

Điều kiện sống của nấm linh chi .................................................................. 8

1.1.4

Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi .................................. 8

1.1.5

Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi............................................................. 13

1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) ............................................ 16
1.2.1 Vị trí phân loại................................................................................................ 16
1.2.2 Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 17
1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen ............................................................ 19
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 20
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 20

i


2.2 Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................... 20

3.2.13 Định tính acid uronic.................................................................................... 41
3.2.14 Định tính acid hữu cơ ................................................................................... 41
3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen ......... 44
3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol.................. 44
3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng................................. 45
3.4 Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum
..................................................................................................................................... 47

3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi ................................... 47
3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết ............................................ 49
3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A. subresinosum
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................. 55
Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 59
4.1 Kết luận ................................................................................................................ 59
4.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 60
PHỤ LỤC

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DMSO

: Dimethylsunfoxide

DPPH

: 2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl


: Ultra Violet

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi .......................... 8
Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi ................... 10
Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)............................... 13
Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen. ........... 31
Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết .......................... 42
Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi.................... 43
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên ................... 44
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được .......................... 46
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa
thạch .......................................................................................................................................... 47
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được ......................... 50
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được .................. 51
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được ................ 52
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được .......................... 53

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi .................................................................................................. 7
Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi ........................................................................ 7
Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum. (Corner, 1993) ................... 17
Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum ..................................................................................... 19
Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc ................... 22

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được. ..... 50
Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được.
.................................................................................................................................................. 51
Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được.
.................................................................................................................................................. 52
Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được. ......... 53
Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết ................................................................. 54
Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm ............................... 55
Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm ........................ 56
Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm ...................... 57
Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm .................................. 58

vii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc. Các sách
dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhân Linh chi được sử dụng làm
thuốc từ lâu đời. Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được
cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm
sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương”. Đến đời Minh (năm 1590) trong
sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục
bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị
liệu của Linh chi theo từng màu. Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình,
không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với những bệnh về tim mạch, phổi, gan…
Đến nay với sự phát triển Khoa học – kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng
minh tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim
mạch, HIV, viêm gan siêu vi… Chính vì thế, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng
nấm Linh chi vẫn đang được chú trọng. Việc nuôi trồng cũng như thu hoạch quả thể

chuột cống” [15],“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam
(Ganoderma lucidum) trên chuột gây suy gan thực nghiệm” (Nguyễn Thị Mai Anh,
Đào Văn Phan), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao”
(Đoàn Suy Nghĩ) [4], “Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma
subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam” (Nguyễn Minh
Khang) [13].
3. Mục đích nghiên cứu
Nuôi cấy thu nhận sinh khối hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma
subresinosum và khảo sát một số hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cũng như các phân
đoạn cao chiết.

2


4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Thu nhận sinh khối của tơ nấm Linh chi Amauroderma subresinosum.

-

Định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum.

-

Khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng bắt các gốc tự do có trong tơ nấm
Linh chi A.subresinosum.

5. Phương pháp nghiên cứu

-

Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì
có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường
khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ,…

-

Trong các phân đoạn chiết của tơ nấm, cao Methanol được đánh giá có khả năng
kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli,
P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml cũng như khả năng bắt gốc tự do IC50 là
1,094 mg/ml.

-

Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm
có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa
3


của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì
tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất.
-

Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao
Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định
được.

7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp
Đồ án gồm có 4 chương:

▪ Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)
▪ Tử chi (Linh chi tím)
Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại,
trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng
là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa,
5


đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế
bào với hàm lượng rất thấp [17].
Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…,
việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô
lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời
nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.
Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (17201791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là
nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam” [2], giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu
của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược.
1.1.2 Đặc điểm sinh học
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganodermataceae)
Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành
một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi
nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [6].
Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện
với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3 cm.
Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu
đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình
trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh
- vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni. Mũ
nấm có đường kính 2 – 15 cm, dày 0,8 – 1,2 cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc


Nuôi tơ

Ra quả thể

Nhiệt độ

20 – 35oC

25 – 30oC

Ẩm độ

55 – 60%

90 – 95%

pH

4,5 – 6

4,5 – 6

Ánh sáng

Không cần

Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía

1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi

▪ Kích thích hệ miễn dịch cơ thể
▪ Gia tăng khả năng dung nạp oxygen
▪ Giảm gốc tự do hydroxyl
▪ Ức chế khối u phát triển
▪ Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ
▪ Tăng chức năng gan
▪ Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường
▪ Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein
1.1.4.2 Ganoderic Acid
Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm
lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử
ganoderma. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng
G.acid cao thì có nhiều vị đắng.
9


Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen
có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật.
Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng,
mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc
tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexane, eter ethyl,
chloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành
glycosid [14, 16].
Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi [8]
Hoạt chất

Hoạt tính

Ganoderic acid R,S


▪ Giảm độ nhớt máu
▪ Ức chế kết dính tiểu cầu
▪ Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

10


▪ Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin
▪ Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não
▪ Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể
1.1.4.4 Alkaloid
❖ Định nghĩa
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản
ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Tuy nhiên cũng
có một số alkaloid không có nhân dị vòng với nitơ và một số alkaloid không có phản
ứng kiềm. Một số alcacoid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid
trong phân tử. [16]
❖ Tính chất
Đa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alkaloid ở dạng
nhựa vô định hình, một vài akcaloid ở dạng lỏng và có màu. Alkaloid là những hợp
chất có tính base yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ. Tính base của các alkaloid khác
nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alkaloid tính base yếu thì
phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. Các alkaloid ở dạng
tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ:
chloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol
và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: chloroform, eter, benzen. Chính vì
thế, tính hòa tan của các alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alkaloid ra
khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống [14].
❖ Công dụng
Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y

spiroalan, solanidan.

❖ Công dụng [6]
▪ Trị long đờm, chữa ho
▪ Là chất phụ gia trong một số vắc xin
▪ Tác dụng thông tiểu
▪ Tác dụng kháng viêm, chống khối u
1.1.4.6 Germanium hữu cơ
Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm
1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của
12


oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên
đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ
thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm
thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ
duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế
bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều
hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển [21].
Chức năng của Germanium:
▪ Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư
▪ Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ
▪ Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ
1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi
Ở các nước Đông Nam Á, (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…) việc
nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn
về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên
cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý và phương cách điều trị lâm sàng. Giá trị
dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thế giới thành lập


Bạch chi (ngọc chi)

Trắng

Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông
mũi, an thần, chữa ho nghịch.

Hắc chi (huyền chi)

Đen

Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, ích
thận khí.

Tứ chi

Tím

Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức
xương khớp, gân cốt.

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng cụ thể
của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau: [3, 9, 10]
✓ Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn).
✓ Bảo can (bảo vệ gan).
✓ Cường tâm (thêm sức cho tim).
✓ Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hóa).
✓ Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp).
✓ Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc).