BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG TRICHODERMA SPP. TỪ ĐẤT
VƯỜN CACAO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG
CỦA CHÚNG VỚI NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA
GÂY THỐI QUẢ CACAO

Ngành:

CNSH – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện :

LÊ NHẬT ĐĂNG

MSSV: 1151110082

Lớp: 11DSH03

- TP. Hồ Chí Minh, 2015 -

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ
Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa
học 2010 – 2014.
Và cuối cùng tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng làm khóa, các anh chị
khóa 10, các em khóa 12 đã giúp tôi hoàn thành đồ án cũng như trao đổi kinh nghiệm
làm việc trong quá trình làm đồ án.

Tp. HCM, Ngày 10 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Lê Nhật Đăng


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
-------------MỤC LỤC ............................................................................................................. i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. Giới thiệu về cây cacao. .............................................................................. 3
1.1.1. Phân loại. ............................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh thái. .............................................................................. 5
1.1.4 Thành phần hóa học trái cacao................................................................. 6
1.1.5. Tình hình trồng và sản xuất cacao tại Việt Nam. ...................................... 6
1.1.6. Dịch hại trên cây cacao ........................................................................ 9
1.1.6.1. Côn trùng gây hại chính .................................................................... 9

2.1.1. Nguồn mẫu phân lập .......................................................................... 33
2.1.1.1. Nguồn mẫu phân lập nấm bệnh ....................................................... 33
2.1.1.2. Nguồn phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. ............................ 33
2.2.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 33
2.2.4. Hóa chất............................................................................................ 34
2.2.5. Các loại môi trường ............................................................................ 35
2.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 37
2.4.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thối trái trên cacao. .................. 37
- ii -


Đồ án tốt nghiệp
2.4.1.1. Phân lập từ mẫu trái cacao nhiễm bệnh thối trái. ............................. 37
2.4.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm. ........................................... 38
2.4.3.1. Quan sát đại thể nấm sợi ................................................................. 38
2.4.3.2. Quan sát vi thể nấm. ....................................................................... 38
2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy
tắc Koch. ..................................................................................................... 39
2.4.2. Phương pháp phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp .................... 41
2.4.2.1. Các bước thu mẫu ........................................................................... 41
2.4.2.2. Các bước phân lập. ......................................................................... 41
2.4.2.3. Cấy truyền và làm thuần mẫu nấm Trichoderma. ............................ 42
2.4.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm. ........................................... 42
2.4.3.1. Quan sát đại thể nấm sợi. ................................................................ 42
2.4.3.2. Quan sát vi thể nấm. ....................................................................... 43
2.4.5. Định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của các
chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng cacao. .................................. 43
2.4.6. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng nấm Trichoderma spp. ... 44
2.4.6. Khảo sát tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma spp. với chủng
nấm bệnh Phytophthora palmivora trong điều kiện in vitro. ........................ 44

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .................................................................................. 71
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI .............................................................................. 72
TÀI LIỆU INTERNET .................................................................................... 74

- iv -


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
-------  ------1.

CMC:

Carboxymethyl cellulose

2.

ĐC:

Đối chứng

3.

MSM:

Minimal Synthetic Medium

4.



Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG

-------

-------

Bảng 1. 1 : Các thành phần của hạt cacao tươi, tính theo % trọng lượng tươi ........ 6
Bảng 1. 2: Các tỉnh trồng ca cao ở Việt Nam ......................................................... 8
Bảng 1. 3: Một số dịch hại chính trên cacao......................................................... 11
Bảng 1. 4: Bệnh Phytophthora trên một số cây trồng ........................................... 20
Bảng 1. 5 : Nguồn lây nhiễm gây bệnh thối trái do nấm Phytophthora spp. trên
cacao. .................................................................................................................. 22
Bảng 2. 1 : Nguồn tráí cacao nhiễn bệnh thối trái ................................................ 33
Bảng 2. 2: Nguồn đất phân lập Trichoderma. ...................................................... 33
Bảng 3. 1: Tần xuất xuất hiện chủng nấm Phy.1 .................................................. 47
Bảng 3. 2: Tỷ lệ trái cacao bị nhiễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo.................... 50
Bảng 3. 3 : Kết quả tái phân lập lại tác nhân gây bệnh sau khi tái nhiễm trên trái
cacao sạch bệnh theo quy tắc Koch...................................................................... 50
Bảng 3. 4. Đường kính tản nấm (mm) sau 3 ngày nuôi cấy tại các nồng độ muối
khác nhau ............................................................................................................ 60
Bảng 3. 5: Đường kính tản nấm Phytophthora palmivora sau các ngày theo dõi khả
năng đối kháng với nấm Trichoderma. ................................................................ 62
Bảng 3. 6: Tỷ lệ % đối kháng giữa nấm Phytophthora palmivora và nấm
Trichoderma. ....................................................................................................... 62

- vi -



Hình 3. 10: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc4 ..................................................... 55
Hình 3. 11: Hình thái vi thể của chủng Tcc4. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào
tử. ........................................................................................................................ 55
Hình 3. 12: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc5 ..................................................... 56
Hình 3. 13: Hình thái vi thể của chủng Tcc5. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào
tử. ........................................................................................................................ 56
Hình 3. 14: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc6 ..................................................... 57
- vii -


Đồ án tốt nghiệp
Hình 3. 15: Hình thái vi thể Tcc6. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. ...... 57
Hình 3. 16: Đường kính vòng phân giải cơ chất chitin huyền phù của 6 chủng nấm
Trichoderma phân lập được. ................................................................................ 58
Hình 3. 17: Vòng phân giải cơ chất chitin huyền phù của các chủng nấm phân lập
được (sau 2 ngày nuôi cấy) .................................................................................. 58
Hình 3. 18: Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cơ chất CMC của các chủng
Trichoderma phân lập được. ................................................................................ 59
Hình 3. 19: Vòng phân giải cơ chất CMC của các chủng Trichoderma phân lập được
sau 2 ngày nuôi cấy ............................................................................................. 59
Hình 3. 20: Biểu đồ thể hiện đường kính tản nấm Trichoderma phân lập được sau 3
ngày nuôi cấy tại các nồng độ mưới khác nhau. (ĐV: mm) .................................. 61
Hình 3. 21: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 3 ngày đối
kháng trực tiếp trong đĩa petri .............................................................................. 63
Hình 3. 22: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 5 ngày đối
kháng trực tiếp trong đĩa petri. ............................................................................. 64
Hình 3. 23 : Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 7 ngày đối
kháng trực tiếp trong đĩa petri .............................................................................. 65
Hình 3. 24: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 9 ngày đối
kháng trực tiếp trong đĩa petri .............................................................................. 66

palmivora gây thối quả cacao”
2. Mục đích nghiên cứu đề tài:
Tìm được chủng nấm Trichoderma spp có hiệu quả khống chế nấm Phytopthora
palmivora gây bệnh trên thối trái trên cây cacao. Đồng thời bổ sung chủng nấm mới
vào bộ sưu tập Trichoderma cho phòng thí nghiệm Hutech.
Muc tiêu cụ thể
- Phân lập được chủng nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối trái trên cacao.
- Phân lập một số chủng nấm Trichoderma từ đất trồng cacao và xác định được một
số đặc điểm sinh học của chúng.
-1-


Đồ án tốt nghiệp

- Xác định được khả năng đối kháng nấm Phytopthora palmivora của các chủng nấm
Trichoderma phân lập được trong điều kiện in vitro.
3. Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập nấm Phytopthora palmivora gây bệnh thối trái ca cao
- Phân lập các chủng nấm Trichoderma trên đất trồng cacao.
- Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng nấm Phytopthora
sp. của các chủng nấm Trichoderma spp trong đĩa petri.
- Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm
Trichoderma thu nhận được trong điều kiện in vitro.

-2-


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cây cacao (Theobroma cacao) thuộc:
 Giới: Plantae
 Bộ: Malvales
 Họ: Malvaceae
 Phân họ: Byttnerioideae
 Chi: Theobroma
 Loải: T.cocoa

Hình 1. 1: Cây cacao
(Theobroma cacao)
Chi Theobroma gồm 22 loài, trong đó chỉ có loài Theobroma cacao là có giá trị kinh
tế. Theobroma cacao được chia ra làm 2 loài phụ :
+ Criollo: có nguồn gốc từ Trung Nam Mỹ. Đặc điểm rất thơm, ít đắng nhưng năng
suất thấp, khả năng kháng bệnh kém, trồng 4-5 năm mới có trái. Hiện nay giống này
không được trồng phổ biến
+ Forastero: là các giống cacao thường gặp ở Brazil và Tây Phi, Trung Nam Mỹ,
Malaysia, Indonesia…Đặc điểm: năng suất cao và kháng sâu bệnh nhưng chất lượng
trung bình. Hiện chiếm 80 % nguyên liệu sản xuất chính trên thế giới.
Ngoài ra còn có nhóm Trinitario là nhóm lai giữa hai nhóm Criollo và Forastero. Đặc
điểm: năng suất cao và kháng bệnh tốt. Chiếm 15 % sản lượng chế biến của thế giới.
(Intermediate technology development group, 1999).
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ có thể cao đến 10 - 20 m nếu mọc tự nhiên trong
rừng. Trong sản xuất do trồng mật độ cao và khống chế sự phát triển thông qua tỉa
cành nên cây thường có chiều cao trung bình khoảng 5 - 7 m, đường kính thân từ 10
-18 cm. Cacao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó có thể trồng xen với các loại cây
kinh tế khác. Thời kỳ kinh doanh hiệu quả có thể kéo dài từ 25 - 40 năm. Lá dài 25
cm, màu đậm, hình gân lông chim. Thân cây do thụ tinh, mỗi năm cho đến hàng nghìn
hoa ở thân chính và cành to nhưng chỉ có 1 - 3 % thành trái. Sau khi thụ phấn trái
-4-

tính như: giâm, ghép và chiết cành. hạt (Intermediate technology development group,
1999)

-5-


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4 Thành phần hóa học trái cacao.
Bảng 1. 1 : Các thành phần của hạt cacao tươi, tính theo % trọng lượng tươi
Thành phần
Chất nhầy Vỏ hạt Phôi nhũ
Nước

84.5

9.4

35

Chất béo (bơ

-

3.8

+ Cellulose

-


10

-

1.1

0.6

18

8.4

31.3

cacao)
Carbonhydrat

+ Fructose
Nitrogen
+ Protein
+ Theobromine

-

-

2.4

+ Enzyme


100

100

100

Acid hữu cơ
Citric và
Acetic,Oxalic

Nguồn: F. Hardy (1960)
1.1.5. Tình hình trồng và sản xuất cacao tại Việt Nam.
Hiện nay, việc phát triển cây ca cao tại nước ta dựa theo vùng quy hoạch
sản xuất. Mặc dù điều kiện của các địa phương đều thích hợp cho cây phát triển. Song
hạt ca cao chỉ mới là mặt hàng để xuất khẩu. Trong nước hiện chưa có cơ sở tiêu thụ
sản phẩm. Một lượng nhỏ sản lượng ca cao được các cơ sở thủ công tại địa phương
-6-


Đồ án tốt nghiệp

thu mua và sản xuất theo phương pháp thủ công. Với dự án Success Alliance được
triển khai ở nước ta từ năm 2002, người nông dân trồng ca cao được hỗ trợ mọi mặt.
Đây là một chương trình do Bộ Nông nghiệp Mỹ hỗ trợ và tổ chức phi Chính phủ Mỹ
ACDI- VOCA triển khai để hỗ trợ đào tạo về kĩ thuật giúp nông dân trồng ca cao đạt
chất lượng xuất khẩu, đồng thời liên kết các tổ chức thu mua, chế biến sản phẩm cho
người nông dân.
Hiện tại, Bộ nông nghiệp Mỹ (USDA) đang hỗ trợ 4 triệu USD để mở các
đợt tập huấn cho nông dân trồng và nâng cao diện tích canh tác cây ca cao; Cơ quan
phát triển quốc tế Mỹ (USAID) tài trợ 800000 USD để giúp Việt Nam trở thành một

Bảng 1. 2: Các tỉnh trồng ca cao ở Việt Nam
STT
Tỉnh

Năm 2003 (ha)

Năm 2004 (ha)

1

Bà Rịa - Vũng Tàu

28

100

2

Bến Tre

260

500

3

Bình Định

10


25

15

9

Gia Lai

5

10

Hồ Chí Minh

3

11

Lâm Đồng

10

12

Long An

2

13


19

Các tỉnh khác

10

50
120

5
120

Tổng Cộng

1002

1905

Ban điều phối cacao Việt Nam (VCC) - 2005

-8-


Đồ án tốt nghiệp

1.1.6. Dịch hại trên cây cacao
Theo Phạm Hồng Đức Phước (2013)
Tương tự như bất kì loại cây trồng nào khác, cacao cũng có thể bị rất nhiều bệnh.
Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chất lượng trái cacao, nghiêm
trọng hơn là gây thất thu cho người trồng. Bệnh có thể xảy ra ở bất kì giai đoạn nào của

 Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (Phythophthora palmivora)
Triệu chứng và tác hại: Đây là bệnh hại chính trên ca cao. Bệnh xuất hiện trong
suốt thời gian sinh trưởng của cây, từ vườn ươm cho đến khi thu họach, bệnh tấn công
khắp bộ phận trên cây (trên thân, lá, hoa, trái non, trái già), bệnh có mặt hầu hết các
vùng trồng ca cao và đặc biệt phát triển mạnh trong điều kiện mùa mưa, ẩm độ
cao. Ngoài ca cao Phytophthora còn có nhiều ký chủ khác như: sầu riêng, cao su, bơ,
đu đủ, cây có múi, …
Bệnh phát tán mạnh từ 2 nguồn chính là từ đất và từ trái bệnh:


Từ đất: Nước mưa làm bắn đất có mang mầm bệnh lên cây, lá, trái. Kiến, mối di
chuyển từ đất lên cây mang theo mầm bệnh.



Từ trái bệnh: bào tử phát tán do gió, mưa, các loại côn trùng (bọ cánh cứng Scolytid
và Nitidulid).
 Bệnh nấm hồng (Corticium salmonicolor)
Triệu chứng và tác hại Bệnh thường chỉ xuất hiện vào mùa mưa, ở những vườn ca
cao quá ẩm và rợp do tán lá dày và mật độ cây trồng cao. Nấm tấn công ở những cành
đã hóa nâu. Nấm bệnh lúc đầu có màu mốc trắng nhưng dần chuyển sang màu trắng
hồng, hoặc vàng. Tên bệnh được đặt theo màu của nấm trong giai đoạn này. Đây cũng
là giai đoạn nấm phóng thích bào tử và phát tán mầm bệnh. Nấm mọc sâu vào phần
gỗ cành. Lá phần trên của cành nhiễm bệnh sẽ vàng và khô nhưng vẫn lưu trên cành
một cành một thời gian. Cành khô nâu sẽ chết, lớp vỏ thân cành bị tách ra từng mảng.
Nếu điều kiện nắng khô trở lại, bệnh phát triển chậm lại và cây có thể phục hồi nhưng
dễ tái phát nếu mưa trở lại mà không có biện pháp cải thiện như vệ sinh đồng ruộng
hoặc xử lý thuốc.
 Bệnh hại rễ (Rigidoporus lignosus, Ganoderma pseudoferum, Phellinus noxius,
Rosellinia bunodes)


3

Thối eo giữa
trái

Witches´

Nấm Moniliophthora

Chồi non, hoa

Broom

perniciosa

và trái

Virus

Chồi non

Swollen Shoot
Virus
Frosty Pod Rot

4

Nấm Hồng


Monilia sp.

Trái non

Cành, thân
Trái

Colletotrichum
gloeosporioides

Charcoal pod

Botryodiplodia

rot

theobromae

Vascular-streak

Oncobasidium

Lá, đỉnh chồi,

dieback (VSD)

theobroma

cành và thân.



14

lá, hoa và trái.
Thân, cành và

Helopeltis spp.

Cocoa Pod

Conopomorpha

Trái non lẫn

Borer

cramerella

trái già

Ring Bark

thân

Borers

Bọ trĩ

Thrips



Mối

hainanensis, O.

Termite

Gốc, thân

formosanus and
M. pakistanicus
Proof rat or

16

Chuột

17

Sóc

Squirel

13

Bọ trĩ

Thrips

Rattuus rattus

Năm 1995, Hawksworth và công sự đã xác định Phytophthora thuộc phân loại:
Giới:

Chromalveolata

Ngành:

Heterokontophyta

Lớp:

Oomycetes

Bộ:

Peronosporales

Họ:

Pythiaceae

Chi:

Phytophthora

Hình 1.2: Phân loại của lớp nấm trứng Oomycetes (Hawksworth et al. 1995)

- 13 -