BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA VI KHUẨN
Bacillus subtilis Natto

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn

: ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT
ThS. PHAN TRUNG HẢI

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ MINH TRANG

MSSV: 1211100022

TP. Hồ Chí Minh, 2016

Lớp: 12DSH01

cho em có cơ hội được đi thực tập.
- Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo
điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình.
- Em xin cảm ơn ThS. Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn
thành đồ án này.
Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của:
Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh
Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi
điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành
luận văn này.
Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ,
giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống.

Sinh viên thực tập
NGUYỄN THỊ MINH TRANG


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................ i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH ........................................................... vi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết .................................................................................................. 1
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 2
3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................................... 3
5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 3

2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................................. 23
2.3. Môi trường nuôi cấy...................................................................................... 23
2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) ................... 23
2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) ........................... 23
2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) ............ 24
2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) ............................... 24
2.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 25
2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 25
2.4.2. Phương pháp tăng sinh .......................................................................... 25
2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào .................................................... 25
2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease ............................. 26
2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn .............................................................. 27
2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn ........................... 27
2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease .................................. 27
2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease ........................................................ 30
2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê .................................................................. 30
2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30
2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme
protease cao ..................................................................................................... 30

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus
subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ....... 30
2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme
protease của chủng Bacillus subtilis Natto ..................................................... 31
2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng


Aspergillus oryzae

B.

Bacillus

B. subtilis

Bacillus subtilis

BDN

Bã đậu nành

CB

Cám bắp

CG

Cám gạo

CM

Cám mì

CFU

Colony Foming Unit


Phần mềm xử lý thống kê
(Statistical Package for the Social Science)
Trọng lượng phân tử

TLPT

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis ................................... 8
Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus
licheniformis N-2 ................................................................................... 15
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng
Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 16
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng
Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 17
Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu ............................................................ 22
Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine ................................................................... 28
Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ........................... 29
Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn ........ 31
Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng
B. subtilis Natto ..................................................................................... 34
Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần
nuôi cấy khác nhau ................................................................................. 35
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ
protease ................................................................................................... 38


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và
được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40]. Bacillus subtilis Natto là
một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có khả năng phát
triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase,
protease, phytase, hemicellulase, glucannase… Chủng vi khuẩn này đã được sử
dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu. Khi ủ ấm với hạt đậu nành,
chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và
chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54]... Nhiều nghiên cứu về B. subtilis Natto
đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều
enzyme nhóm protease như nattokinase[33], elastase[32], bacillopeptidase F

[45]

…

Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và
nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu
hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh... Tuy nhiên, việc
nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa
nhiều. Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”.
Ý nghĩa đề tài nghiên cứu:
- Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của
Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế
phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam.

của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ
phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO…
3. Mục tiêu nghiên cứu
Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme
protease cao từ các chủng nghiên cứu.

2


Đồ án tốt nghiệp

Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh
tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất.
Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B.
subtilis Natto.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto
khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành
phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy.
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng
Bacillus subtilis Natto.
5. Phương pháp nghiên cứu
Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử.
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0.
Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài:

- Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
- Phương pháp tăng sinh.
- Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc).

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu.
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
- Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài.

4


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto
1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto
Giới

Bacteria

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Bộ

Bacillales

Họ


Natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả
năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]. Trong dòng B. subtilis Natto còn có nhiều loại
như B. subtilis Natto B – 12

[21]

, B. subtilis Natto OK2

3666 [39]…

5

[47]

, B. subtilis Natto NRRL


Đồ án tốt nghiệp

Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc
chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng
14 - 18 giờ[25],[46]. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được
hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu,
gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B. mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt
đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình
qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis
Natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh
dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi
khuẩn B. subtilis Natto[46].

như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua... [40].
1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái
B. subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào
tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với
nhau thành chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn
và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề
mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23].

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần).
“Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”
1.1.4.2. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể
phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt
độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC. Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly

7


Đồ án tốt nghiệp

giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40oC,
bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0oC. B. subtilis Natto phát triển ở pH
trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự nảy
chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [23].
1.1.4.3. Đặc điểm sinh hoá


Khử nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

8


Đồ án tốt nghiệp


; cellulase theo Sun Yan năm 2011

[48]

[29]

, Shimizu M năm

; và nhóm enzyme được nghiên cứu

nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53].
Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis Natto như sau:
o

Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay

subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có
275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến
29 kDa

[21],[33]

. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được

nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.
o

Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42].

Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt

Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm
phụ:


Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch

polypeptit


Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của

mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.


Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.



Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc

10


Đồ án tốt nghiệp


o Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serine.
Trong bốn protease kể trên, các protease - xerin và protease - thiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase
của các dẫn suất của amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được
nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác
dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương
đối bé, nhất là các P-xerin.
Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20,000 – 27,000 Dalton.
Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme
của Pelicillium cyoneo-fulvum (44,000), Asp, oryzae OUT 5038 (52,000). Trọng
lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33,800
– 48,400). Protease thiol và nhiều protease - acid cũng có trọng lượng phân tử vào
khoảng 30,000 - 40,000 Dalton.
1.2.3. Nguồn thu nhận
Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc
tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn
thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật,
thực vật và vi sinh vật.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở
vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và
xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống .

12


Đồ án tốt nghiệp





Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme

của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản
xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp
được.


Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền

và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt
môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng
của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme. Chính vì thế enzyme
được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác.


Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác

nhau[9].

13


Đồ án tốt nghiệp

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis[7],[16]
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh
vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, độ

+ Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có
khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976).


Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của protease vi khuẩn

phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease. Thông thường hoạt tính của protease có thể

14


Đồ án tốt nghiệp

giữ được trong khoảng từ 60 - 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian.
Hoạt động của protease chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn.
Protease của Bacillus subtilis sinh tổng hợp hoạt động tốt nhất trong khoảng thời
gian 46 - 68 giờ.


Ảnh hưởng của nguồn carbon: nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh

vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và cả polysaccharide (tinh bột), đặc
tính tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc
tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trường
nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Ở vi khuẩn
Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi nguồn carbon là
tinh bột với nồng độ khoảng 8%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống còn 2% sẽ làm
giảm một phần hoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy.
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease
của chủng Bacillus licheniformis N-2

368

“Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008)[37] ”


Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen

trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối vô
cơ. Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3.
+ Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng
hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các

15


Đồ án tốt nghiệp

nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám,
nấm men tự phân, pepton và protein. Trong các nguyên liệu này đều có hàm
lượng amino acid tương đối thấp.
+ Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể
quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006). Theo Ngô
Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên
khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã
dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4,
NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ
pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác. Kết quả là sự phối hợp giữa
nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là
0,038 UI/ml so với các nguồn khác.
+ Khi cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo,


90,1

NH4HCO3

107

NH4Cl

19,6

“Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008) [37]”

16