i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÝ THỊ THANH HÀ

LÝ THỊ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN
NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

L LÝ THỊ THANH HÀ
THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN
NHI TRUNG ƯƠNG
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

nghiên cứu này!
Bố, mẹ là những người đã mang tôi đến với cuộc sống;chồng và các con của
tôi đã luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Tôi xin được chia sẻ thành quả này
với bố, mẹ và gia đình tôi. Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng.
Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018
Tác giả
Lý Thị Thanh Hà


ii

sLỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018
Tác giả

Lý T Lý Thị Thanh Hà
hị Thanh Hà


iii

MỤC LỤC


Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................... 23

1.4.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) ............................................. 24
1.4.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) ........................................... 24
1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) ................ 26
1.5.

Tình hình nghiên cứu bệnh  thalassemia tại Việt Nam.......................... 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 28
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 28


iv

2.2.

Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng ............................... 28
2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia ....................................... 28
2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh ......................................................... 29
2.3.

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân................................................................ 29

2.4.


Đặc điểm của nhóm nghiên cứu ................................................................ 40

3.2.

Kết quả xác định đột biến gen β globin .................................................... 40

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA...................................................................... 40
3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng ......... 48

3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen
bệnh  thalassemia. ............................................................................. 67


v

3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia ............................... 81
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................... 88
4.1.

Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và
Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia ........................ 88

4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR ......................................................... 88
4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ........................................................ 90
4.1.3. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 91
4.2.

Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen  globin trên
nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương .................................. 91


Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR,

GAP-PCR

PCR khoảng cách

RT-PCR

Reverse transcrip PCR

MLPA

Multiplex ligation dependent probe amplification

Sequencing

Giải trình tự gen

Multiplex

Phản ứng đa mồi

ASO

Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo

RDB

Reserve dot blot, lai ngược



Chuỗi beta

γ

Chuỗi gamma

δ

Chuỗi delta


vii

ε

Chuỗi epsilon

ζ

Chuỗi zeta

(2β2)

Hemoglobin A

(2δ2)

Hemoglobin A2


Người mang gen  kết hợp mang gen HbE

RBC (1012/L)

Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

HGB (g/dL)

Khối lượng hemoglobin (g/dL)

HCT (%)

Hematocrit (%)

MCV (fL)

Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu

MCH (pg)

Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung
bình hồng cầu (pg)

MCHC (%)

Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ
hemoglobin trung bình hồng cầu (%)

cffDNA



BV Nhi TƯ

Bệnh Viện Nhi Trung Ương

DT-SHPT

Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường .......................................... 5
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia ........................................... 11
Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia .............................................. 16
Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện đột biến
gây bệnh  thalassemia. ...................................................................... 17
Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam......................... 26
Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam....................... 27
Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến
trên trên gen β globin .......................................................................... 31
Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin .................................................. 34
Bảng 2.3. Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin .................... 36
Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm ..................................... 40
Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 
thalassemia .......................................................................................... 41
Bảng 3.3. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 
thalassemia theo vị trí đột biến ............................................................ 42
Bảng 3. 4. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia ..................... 43

Hình 1.2.

Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia ........................................... 8

Hình 1.3.

Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin .................................... 13

Hình 1.4.

Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR ......................................................... 18

Hình 1.5.

Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh. .................................... 24

Hình 1.6.

Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh ......................... 25

Hình 2.1.

Quy trình xác định đột biến gen  globin ........................................... 32

Hình 2.2.

Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin ........................... 37

Hình 2.3.


có đột biến IVS2-654 (C-T) ............................................................... 49

Hình 3.7.

Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện
kiểu gen IVS2-654(C-T) .................................................................... 50

Hình 3.8.

Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713
với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B)........ 51

Hình 3.9.

Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504
có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 51


xii

Hình 3.10. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện
kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 52
Hình 3.11. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504
có đột biến CD71/72(+A) ................................................................... 53
Hình 3.12. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện
kiểu gen CD71/72(+A)....................................................................... 54
Hình 3.13. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT130504 với
đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) ....................................................... 55
Hình 3.14. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215
có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 55

Hình 3.28. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với
đột biến dị hợp tử c.-138C>T ............................................................. 65
Hình 3.29. Kết quả xác định đột biến gen của bệnh nhân mã số
PWBbT120505F và gia đình. ............................................................. 66
Hình 3.30. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của các
đối tượng nghiên cứu. ........................................................................ 68
Hình 3.31. Kết quả điện di bước 1 sàng lọc 4 đột biến CD41/42(-TCTT),
CD17(AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G) của cặp bố mẹ có mã
số WBbT090803 và WBbT090804 .................................................... 71
Hình 3.32. Kết quả điện di bước 2 sàng lọc 4 đột biến IVS2-654(C-T),
CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD95 (+A) của cặp bố mẹ có mã số
WBbT090803 và WBbT090804 ......................................................... 72
Hình 3.33. Kết quả điện di bước 3 sàng lọc đột biến HbE (CD26) của cặp bố
mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804 .................................... 72
Hình 3.34. Kết quả điện di tìm kiểu gen đột biến của người mẹ mã số
WBbT090804. Thay hình khác .......................................................... 73
Hình 3.35. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã
số WBbT110706 ................................................................................ 75
Hình 3.36. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã
số PWBbT120505M .......................................................................... 76


xiv

Hình 3. 37. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã
số WBbTS150926 .............................................................................. 77
Hình 3.38. Kết quả điện di phát hiện đột biến mất đoạn lớn ở người bố.
Hình 3.39. Kiểu gen kết hợp đột biến gen β globin và α globin của 3 gia đình
có các con vừa bị Beta thalassemia thể nặng và phù thai di Alpha
thalassemia thể nặng. ......................................................................... 81

Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến
lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng
ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm
phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn
sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn
đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần
lớn là đột biến điểm. Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và
tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm
lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử
xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán
trước sinh bệnh β thalassemia.


2
Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường
hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh
nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân. Phân
tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền
cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β
Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp
phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra
các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về
kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007).
Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột
biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan,
Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al. 1986, Park,
Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit,
Tanphaichitr et al. 2004). Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen
là kiểu hình trên bệnh nhân  thalassemia


Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp
hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình
thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1,
đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc
một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại
chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ
tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia
bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ
gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β
thalassemia.

Hình 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường

(Nguồn: http://www.tutorialpoint.org/ProvaBiswas/HB_page1.html)
Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào
hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển
chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Cấu trúc phân tử
Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM. Phần Globin có bản chất protein, đặc
trưng cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide,
giống và gắn với nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Vì
vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển
4 phân tử oxy.


5
1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin
Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có
sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống.
Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden
và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi

α2γ2

Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

Hb Gower 1

ζ2ε2

Phôi thai 2-3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai

Hb Gower 2

α2ε2

Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1

Hb PorlDNA

ζ2γ2

Phôi thai 2 - 3 tuần đầu

Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các
loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Gen α globin
hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại
trong suốt quá trình phát triển của cá thể. Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt
động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự
chuỗi này bằng chuỗi khác



gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành


7
mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen
bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%.
Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb
Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một
loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb. Biểu hiện là hồng cầu
nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy. Ở các thể nhẹ, sự mất cân bằng
giữa chuỗi α và chuỗi β không nặng nề nên biểu hiện sự giảm tổng hợp Hb là không
rõ rệt.
Hiện tượng thứ hai: mất cân bằng giữa 2 loại chuỗi globin do thiếu hụt
một loại chuỗi globin nào đó.
Việc thiếu hụt một loại chuỗi globin này sẽ gây ra sự dư thừa tương đối loại
kia. Trong bệnh β Thalalassemia do thiếu hụt chuỗi β gây ra dư thừa chuỗi α globin.
Do tính chất lý hóa của các chuỗi α và “không α” khác nhau nên những rối
loạn do các chuỗi dư thừa gây ra cũng khác nhau. Các chuỗi α dư thừa tạo thành các
hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở
máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu
trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng lọc” ở lách. Mặt khác nó cũng
làm cho màng này tăng diện tiếp xúc, dễ bị các tác nhân oxy hóa và phá hủy. Đồng
thời còn làm thay đổi tính thấm của màng hồng cầu nên kali ở bên trong tế bào thoát
ra ngoài huyết tương. Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm
gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương, các hạt tủa trên gắn lên nguyên sinh
chất và màng của các hồng cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước khi trưởng
thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy, gây nên các biến dạng
xương, tăng hấp thu sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể



Biểu hiện lâm sàng: thiếu máu nhẹ hơn thể nặng nên thường phát hiện bệnh sau 2
tuổi. Nhiều trường hợp không cần phải truyền máu định kỳ, chỉ truyền máu khi Hb
< 70g/L. Xét nghiệm thường có Hb >7g/dl, HbF 20 - 100%, HbA2 < 7%. Bệnh nhân
cũng có thể biểu hiện bệnh rõ như lách to, gan to, biến dạng xương mặt, chậm phát
triển nếu bệnh diễn biến lâu và không được truyền máu đủ. Người có HbE/ 
Thalassemia thường cũng biểu hiện bệnh như thể trung gian. Các trường hợp 
Thalassemia thể trung gian là thể rất ít gặp, rất dễ bỏ sót vì các chỉ số dùng cho mục
đích sàng lọc bệnh Thalassemia không đặc trưng.
1.2.4.3. Thể nặng
 Thalassemia đồng hợp tử đa số là thể nặng, bệnh thường được phát hiện
sớm dưới 2 tuổi, thiếu máu nặng rõ, đòi hỏi phải truyền máu định kỳ, thường 2 - 4
tuần/ 1 lần. Xét nghiệm Hb thường < 7g/dl, HbA2 < 4; HbF >50%. Nếu không được
điều trị hoặc điều trị không đầy đủ sẽ biểu hiện rõ trên lâm sàng: bộ mặt huyết tán
mạn tính với mũi tẹt, gò má cao, bướu trán, bướu đỉnh, gan lách to, xạm da. Ở giai
đoạn muộn còn có các biến chứng như: chậm dậy thì, đái tháo đường, loãng xương,
suy tim... Những bệnh nhân này thường có tuổi thọ nhỏ hơn 20 tuổi (Khanh.1985,
Old, Traeger-Synodinos et al. 2005, Weatherall 2005). Một số trường hợp HbE/ 
Thalassemia biểu hiện như thể nặng.