CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN LỆ HÀ

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày … tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
TT

Họ và tên

Chức danh Hội đồng

1

Chủ tịch

2

Phản biện 1

3

Phản biện 2

4

Ủy viên

5

III- Ngày giao nhiệm vụ:

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 22-08-2016
V- Cán bộ hướng dẫn: TS. NGUYỄN LỆ HÀ
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn
gốc.
Học viên thực hiện Luận văn

Đỗ Tiến Nam


ii

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo nhà trường, quý thầy cô khoa
Công nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường đã khơi nguồn động lực, tin tưởng
giao cho em đề tài đồ án tốt nghiệp “ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE
TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM



v

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………...……i
LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………...…….ii
TÓM TẮT…………………………………………………………...……………..iii
ABSTRACT………………………………………………..………………………iv
MỤC LỤC…………………………………………………………..……………...v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNHẢNH. ..................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu ........................................................................1
Mục đích chung của đề tài nghiên cứu : ..................................................................2
Phương pháp nghiên cứu : .......................................................................................2
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN ......................................................................................3
1.1) Nguồn phế liệu tôm. ......................................................................................3
1.1.1)

Thành phần hóa học trong đầu tôm. .......................................................3

1.1.2)

Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm. .................................4

1.1.3)

Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại…………………...…………6




vi

1.4) Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng enzyme proteaza thủy
phân protein. ..........................................................................................................16
1.4.1)

Các nghiên cứu trong nước : .................................................................16

1.4.2)

Các nghiên cứu ngoài nước: .................................................................17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ..................18
2.1) Nguyên liệu nghiên cứu................................................................................18
2.2) Phương pháp nghiên cứu. .............................................................................18
2.2.1) Quy trình nghiên cứu. .............................................................................18
2.2.2)

Phương pháp phân tích đã áp dụng:......................................................20

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Phương Pháp Amano) .......21
Phương pháp xác định hàm lượng chất khô. ......................................................21
Phương pháp xác định hàm lượng chất tro.........................................................21
2.2.3)

Phương pháp xử lý số liệu: ...................................................................21

2.3) So sánh chi phí lợi ích mở rộng giữa kế hoạch thuỷ phân phế liệu tôm sú

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: .........................................................34

3.2.3)

Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân. ....................................................34


vii

3.3) Thành phần hoá học trong đầu tôm trước và sau phản ứng : ...................35
3.4 ) Hiệu quả kinh tế và khả năng ứng dụng : ......................................................36
3.5 ) Thành phần, tính chất nguồn thải và phương pháp xử lý . ............................ 37
3.5.1) Nguồn thải trong quá trình thủy phân. .....................................................37
3.5.2) Thành phần và tính chất nước thải . .........................................................37
3.5.3) Công nghệ có thể áp dụng để xử lý nguồn thải này. ................................ 38
4.1) Kết luận ..........................................................................................................39
4.2) Đề xuất cho những nghiên cứu tiếp theo ........................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................40
PHỤ LỤC ..................................................................................................................42


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật. ………………19
Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật………………..20
Bảng 3: Thành phần hoá học của đầu tôm trước và sau khi thuỷ phân…………...44

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH.
Hình 1 : sơ đồ Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ

nhiễm môi trường. Bên cạnh đó việc sử dụng protease để thuỷ phân như thế nào
đểđạt hiệu quả kinh tế cao nhất, tránh gâng lãng phí là điều cần thực hiện. Vì vậy đề
tài “Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus
monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm.” được tiến
hành với mong muốn ứng dụng protease để thu được nguồn protein với hiệu suất
cao nhất từ phế liệu tôm sú nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảm
thiểu ô nhiễm môi trường.


2

Mục đích chung của đề tài nghiên cứu :
Mục đích chung của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE
R660L trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất
cao nhất. So với những nghiên cứu khác từ phế liệu đầu tôm thì tính mới của đề tài
này là sử dụng enzyme công nghiệp và xác định điều kiện tối ưu nhằm cho hiệu suất
cao nhất. Bên cạnh đó đề tài này có ý nghĩa về mặt môi trường là tận thu protein
trước cho các mục đích thực phẩm sau đó ta có thể tách chiết để thu chitin và
chitosan,so với một số đề tài khác đã được tiến hành như thu chitin và chitosan từ
phế liệu tôm bằng phương pháp hoá học thì bên cạnh việc tốn hoá chất để khử các
chất khoáng và protein thì sau khi thu chitin và chitosan ta lại phải tốn nhiều hoá
chất để xử lý protein trong nước thải như dùng dung dịch HCl hay dung dịchNaOH,
KOH điều chỉnh pH về điểm đông tụ protein nhằm thu hồi protein trong nước thải
vì protein trong phế liệu tôm hàm lượng cao (25% - 28% ).
Phương pháp nghiên cứu :
Dựa trên các cơ sở dữ liệu và thông tin liên quan từ nguồn tài liệu tham khảo,
nghiên cứu thực hiện bố trí thí nghiệm nhằm ứng dụng enzyme protease TEGALASE R660L vào thủy phân phế liệu tôm và thu nhận dịch lọc sau khi thuỷ
phân. Dịch lọc được ổn định hàm lượng peptid và axitamin, loại bỏ tủa, và được
tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Tuỳ vào nồng độ enzyme, nhiệt độ
thuỷ phân và thời gian sẽ cho ta kết quả thuỷ phân khác nhau như sau.

protein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng
và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng.

-

Canxi: trong vỏ, đầu tôm…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là
muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá
trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây
khó khăn cho quá trình khử khoáng.

-

Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là
astaxanthin.


4

1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm.
Vấn đề xử lí phụ phế phẩm (đầu, vỏ) từ tôm và các phế phẩm từ tôm xuất khẩu hiện
nay đang là vấn đề khó khăn. Hiện tại, các công ty, cơ sở chế biến thuỷ sản cũng đã
có một số giải pháp:
-

Bán tươi (hoặc khô) một phần phụ phế phẩm làm thức ăn gia súc. Việc sử
dụng tươi phế rất đòi hỏi phải tiến hành nhanh chóng nếu chậm nguồn phế
liệu này phân hủy gây ô nhiễm môi trường và là chất độc đối với gia súc, gia
cầm. Việc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn, tốn kém. Phơi nắng thì phụ thuộc
vào thời tiết, mất vệ sinh, và gây ô nhiễm môi trường. Dù phơi nắng hay sấy
khô đều không loại được khoáng và chitin mà 2 chất này gây khó tiêu cho

phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

CH2OCOR1

CH2OH

CHOCOR2 + 3NaOH

CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa

CH2OCOR3

CH2OH

Triaxylglycerol

Glycerol Xà phòng

• Khi khử protein chỉ bằng NaOH năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu
khá lớn vì vậy cần sử dụng NaOH có nồng độ cao, trong thời gian dài, dẫn
đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng của
protein tách ra. Bên cạnh đó, quy trình này còn tạo ra một lượng chất thải
lớn, trong đó có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý với khối
lượng lớn. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khi
thải ra môi trường.
 Do vậy, việc nghiên cứu và đưa ra giải pháp xử lý protein trong đầu tôm là
cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho việc xử lý, nâng cao giá trị sử dụng
của phụ, phế phẩm từ tôm. Đồng thời nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành
công nghiệp chế biến tôm và hạn chế ô nhiễm môi trường do phụ, phế phẩm
từ tôm cũng như lượng chất thải từ việc xử lý nguồn phế phẩm này.

tế bào,cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng
từ vi sinh vật(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...).

-

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm
khácbiệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiềuenzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân
tử nên rất khótáchra dưới dạng tinh thể đồng nhất.

-

Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường cótinh đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

-

Protease được phân chia thanh hai loại: endopeptidase va exopeptidase.


7

-

Dựa vào vị tri tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗipolypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide
hoặc một tripeptide.

• Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tim thấy ở vi khuẩn,nấm
mốc cũng như cac vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính va hoạt độ giảm mạnh dưới tac
dụng của EDTA.
-

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
• Protease acid: pH 2-4
• Protease trung tính: pH 7-8
• Protease kiềm: pH 9-11

1.2.2) Tính chất chung của một enzyme:
-

Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung
tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính
này để tách chiết chúng.

-

Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium),
ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme.

-

Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt
hóa hay ức chế.

-


tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các
nhómnàytrongphản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung
tâm của enzyme.
• PH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân
tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp
vớienzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất.

-

Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của
enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng
của sản phẩm. Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để. Mặt
khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để,
như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây
lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu.

-

Ảnh hưởng của nồng độ muối: muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt độngcủa vi
sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng
bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân. Mặt khác, muối ăn còn điều
vị mặn tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì
thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm
hãm sự hoạt động của enzyme.


10

-


-

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:
Đối với các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỉ lệ với nồng
enzyme. Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi


11

của tốc độ thủy phân là không đáng kể. Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ
enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành.
-

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
Trong các phản ứng do enzyme và cơ chất, trước hết phải tạo thành phức
trung gian giữa enzyme và cơ chất. Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo
thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử
của cơ chất khác. Nếu nồng độ cơ chất đầy đủ thích hợp với lượng enzyme sẽ
làm quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng.


12

Proteaza từ thực vật

Enzyme

Cấu trúc và chức năng

Bromelin


quyết định hoạt

protein tự

xylose và 1

tính của papain. nhiên (protein
sữa, đậu

fructose.

nành,…)

Nhiệt độ

Nhiệt độ thay đổi

Chịu được

Hoạt động 30 -

làm ảnh hưởng

nhiệt độ tương

80 C. Nhiệt độ

hoạt tính của


thuộc cơ chất

enzym ổn định)

thuộc vào loại

có thể chịu

cơ chất:

được pH = 1,5

gelatin: pH =

và pH = 8,5.

5, casein: pH =

enzyme
pH

Papain dạng ổn

pH hoạt động

9.5
Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật.


13

enzym
đông tụ
sữa
Rennin
chứa nhiều
a.acid tính
acid hơn
a.acid
kiềm (thấp

Xúc tác phản
ứng chuyển
hóa đạm,
đường, chất
béo và một số
chất khác ở
trong ruột

Cắt LK

Cấu tạo từ 3

của lysine

sợi

a.acid bất

polypetide:


pH = 2,3 –

1.5 - 2.4

6,8

pH tối ưu

trong kiềm và 8
bất hoạt trong pH thích
acid mạnh.

hơp là 7,8-

pH tối ưu là
8-9

9,5
Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật.


14

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng :
Enzyme Protease sử dụng ở đây là TEGALASE R660L thủy phân protein trong đầu
tôm thành polypeptid.
-

Liều lượng: 0.5 - 1kg enzyme/1 tấn protein khô


Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong
sản xuất formate, sữa đông tụ.

-

Sản xuất bia: pepsin, ficin,…rất tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia

-

Sản xuất chất tẩy rửa: Enzyme có những tác dụng giảm thời gian giặt, giảm
lượng nước tiêu thụ

-

Trong thực phẩm : do bản chất sinh hóa khác nhau giữa các bộ phận hình
thái học của động vật thủy sản, người ta có thể sử dụng enzyme để thực hiện
quá trình phân giải một cách có định hướng vào những mục đích như loại da
cá đuối, cá trích, các loại cá da trơn…., tách vỏ hàu, hến, tôm, mực…Phương
pháp cho hiệu suất cao hơn nhiều lần so với thực hiện thủ công hay hóa học.
• Bên cạnh đó protease còn có thể làm sạch vảy cá, bóc tách màng và
cơ quan nội tạng thủy sản.


15

• Sử dụng enzyme protease trong tách chiết carotenoprotein từ phế liệu
của quá trình chế biến các loài giáp xác hiện nay là một hướng nghiên
cứu đang rất được chú ý vì giúp nâng cao lợi nhuận sản xuất giảm
thiểu ô nhiễm môi trường. Carotenoprotein từ đầu, vỏ tôm hiện đang
rất được quan tâm để sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người vì

xuất huyết thanh miễn dịch.

-

Ứng dụng đặc tính của papain, trypsin, bromelin…để SX dược phẩm.

-

Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng

-

Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…