BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CÁC NHÓM TÔM
SÚ (PENAEUS MONODON) LÀM VẬT LIỆU BAN
ĐẦU CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.s Bùi Thị Liên Hà
Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Thanh Trúc

MSSV: 115 111 0388 Lớp: 11DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt
nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

trong quá trình thực tập.
Em xin trân trọng cảm ơn chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị đang công tác
tại phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã
trực tiếp hướng dẫn cũng như tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập.
Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh và
ủng hộ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài báo cáo này.
Tuy đã rất cố gắng nhưng không tránh khỏi thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý
quý báu từ quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn.

ii


Đồ án tốt
nghiệp
MỤC LỤC
LỜI

CAM

..........................................................................................................i

ĐOAN
LỜI

ƠN..............................................................................................................
LỤC

ii

..................................................................................................................


3


Đồ án tốt
nghiệp
1.3.5.1. Cơ chế hình thành Microsatellite........................................................22
1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite ....................................................................22
1.3.6. Các phương pháp phát hiện Microsatellite ...............................................23
1.3.6.1. Phương pháp lai ..................................................................................24
1.3.6.2. Phương pháp PCR ...............................................................................24
1.3.6.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite ...............................25
1.4. ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ....................28
1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ..........................29
1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ...........................................................29
1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR ....................................................30
2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI ......................................................................................31
2.6.1 Điện di trên gel agarose. .............................................................................31
2.6.1.1 Khái niệm .............................................................................................31
2.6.1.2 Các bước thực hiện ..............................................................................32
2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE) ....................................33
2.6.2.1. Nguyên tắc ..........................................................................................33
2.6.2.2. Cơ chế điện di .....................................................................................33
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................34
2.1 Vật liệu ..............................................................................................................35
2.1.1 Vật liệu sinh học .........................................................................................35
2.1.2 Hóa chất ......................................................................................................36
2.1.2.1 Mồi (primer) .......................................................................................36
2.1.2.2 Thang (ladder) ......................................................................................38
2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA. ........................................................................38

Gia Hóa và Nội Địa .............................................................................................56
3.2.3. Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite L1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa. ............................................................................................57
3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu ........................................................................59
3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite W1. .................................60
3.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite P1. ...................................60
3.3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite L1...................................61
3.3.4. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite N1 ..................................62
3.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn. ..........................................................64
3.4.1. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite W1..64
3.4.2. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite L1 ...65
3.4.3. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite P1 ...66

5


Đồ án tốt
nghiệp
3.4.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite N1...67
3.5. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi
microsatellite. ..........................................................................................................69
3.5.1. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR ....................................69
3.5.2 Sàng lọc các cặp mồi microsatellite ...........................................................72
3.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền của bốn quần đàn tôm sú .......................74
3.6.1 Kết quả thông tin đa hình của 4 quần đàn tôm sú: Ấn Độ Dương, Thái
Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. ......................................................................74
3.6.2 Sự khác biệt di truyền của các quần đàn mẫu phân tích ............................78
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................80
4.1 Kết luận .............................................................................................................81

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
GTE : Glucose-Tris-EDTA
He : Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi)
Ho : Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện)
HWE : Cân bằng Hardy - Weinberg
ISSR : Inter Simple Sequence Repeats
M : Ladder DNA (thang DNA)
Marker : Chỉ thị
mM : Milimolar (milimol/lite)
Na : Number of alleles per locus (số lư ợng alen trên
locus) NS : không khác biệt có ý nghĩa
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Polymerase chain reaction
CE : Capillary Electropherosis (Điện di mao quản)
EOF : Electro – Osmotic Flow xi

vii


EFF : Electric Field Force
PIC : Polymorphic Information Content (thông tin đa hình)
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SSR : Single sequence repeat - Microsatellite
STE : Sodium Chloride-Tris-EDTA
RE : Restristion Enzyme (enzyme cắt giới hạn)
Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
TBE : Tris Borate EDTA
Tm : Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)
VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon) ....................................13
Hình 1.5. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. .................................................25
Hình 1.6. Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. .....................26
Hình 2.1. Thang chuẩn DNA 100bp..........................................................................38
Hình 2.2 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi
.....................................................................................................................................50
Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ .................................................................................56
Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ .................................................................................57
Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ .................................................................................58
Hình 3.5. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................60
Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................60
Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................61
Hình 3.7. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................62
Hình 3.8. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite N1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................63
Hình 3.9. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite W1 ..65
Hình 3.10. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite L1 .66
Hình 3.11. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite P1 .67

10


Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 .67

Do đó, để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt
cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên
hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi
sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần
thiết.
Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ, biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao, hồ
chứa nước... với thành phần giống loài thủy sản phong phú là tiềm năng to lớn để
phát triển và nuôi trồng thủy sản. Năm 2012, diện tích nuôi trồng thủy sản toàn
quốc ước tính 1.200.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm phần lớn với
622.118 ha chiếm 88,1%, hàng thủy sản Việt Nam đã có mặt ở trên 164 quốc gia và
vùng lãnh thổ trên thế giới. Kim ngạch xuất khẩu năm 2014 đạt 7,9 tỷ USD, tăng
gấp 18% lần so với cùng kì năm trước. Sự tăng trưởng này chủ yếu nhờ vào kết quả
xuất khẩu của mặt hàng tôm, với giá trị xuất khẩu cao nhất từ trước tới nay khoảng
4,1 tỷ USD, tăng 25% so với năm 2013 (http://xttm.agroviet.gov.vn/).

2


Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng
di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở
khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này
như “Nghiên cứu buồng trứng và khả năng sinh sản của các dòng tôm sú gia hóa”
(Nguyễn Văn Bình, 2012), “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm
sú (Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp microsatellite”
(Nguyễn Thị Thảo và ctv, 2004) với mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt,
cải thiện di truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan
trọng là sức sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền.
Các nghiên cứu xác định biến dị di truyền kết hợp với các biến dị hình thái thể hiện
về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú,
giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết,

330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Kết quả phân
tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ
0,638 – 0,743. Sự khác biệt có ý nghĩa về cân bằng di truyền Hardy – Weinberg
(p
- Đưa ra nhận định hỗ trợ cho chương trình chọn giống tôm sú.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon)
làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” bao gồm 4 chương:


Chương 1. Tổng quan tài liệu: tóm tắt về các đặc điểm, đặc tính của đối tượng
nghiên cứu là loài tôm sú (Penaeus monodon). Giới thiệu về kỹ thuật microsatellite
và các cặp mồi microsatellite sử dụng trong báo cáo này.
Chương 2.Vật liệu và phương pháp: nêu ra các vật liệu sử dụng và những phương
pháp dùng để phân tích trong đề tài.
Chương 3. Kết quả và thảo luận: báo cáo về các kết quả đã đạt được trong đề tài và
đưa ra nhận xét, so sánh với các nghiên cứu liên quan.
Chương 4. Kết luận và kiến nghị: đưa ra các kết luận chung về các kết quả đã đạt
được và đề xuất các hướng giải quyết tiếp theo để hoàn thiện hơn.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1 Giới thiệu về tôm sú
1.1.1 Vị trí phân loại
Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương
được nuôi để dùng làm thực phẩm, là đối tượng rất quan trọng trong lĩnh vực
nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản. Theo Hothuis (1980) và Barnes (1987) (trích dẫn
bởi Nguyễn Văn Chung và Trần Ngọc Hải, 2004) tôm được phân loại trong hệ
thống phân loại như sau:
Ngành: Arthropoda
Lớp


Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon)
Quan sát cơ quan bên ngoài của tôm sú gồm các bộ phận sau:
Chủy: tôm sú có chủy dài kéo dài đến rìa của cuốn râu I, hơi cong lên ở vuốt, hình
dạng như lưỡi kiếm, có răng cưa ở phía trên lưng và cả phần phía dưới, nhờ có răng
cưa này mà ta phân biệt được các loài tôm khác nhau trong giống penaeus. Với tôm
sú, phía trên chủy có 7-8 răng và phía dưới chủy có 3 răng:


Antennule và Antennae là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho cơ thể của tôm.
3 cặp châm hàm: giúp cho việc ăn
5 cặp chân ngực: giúp để ăn và bò
5 cặp chân bụng: dùng để bơi.
Hai đôi mắt kép có 2 cuống mắt
Carapace có gai râu và gai gan nhưng không có gai hốc mắt.
Đuôi có một cặp chân đuôi giúp cho tôm có thể bơi lên cao hay bơi xuống thấp.
Cơ quan sinh dục nằm ở dưới bụng: tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có
kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ
quan sinh dục phụ bên ngoài. Petasma và thelycum là cơ quan phân biệt đực cái ở
tôm, Petasma có ở con đực và thelycum có ở con cái.
Con đực: cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên
ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục
đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi.
Con cái: buống trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở
khớp háng đôi chân ngực thứ 3. Thelycum nằm giữa gốc đôi chân bò thứ 4 và 5.
1.1.4 Chu kì phát triển.
Vòng đời của tôm sú chia làm 6 thời kì: phát triển phôi, ấu trùng và hậu ấu trùng,
giai đoạn ấu niên, giai đoạn thiếu niên, giai đoạn sắp trưởng thành, giai đoạn trưởng
thành (Nguyễn Văn Chung và ctv, 1997)
Phát triển phôi: trứng tôm sú hình cầu, màu vàng xanh, đường kính trung bình
0,3mm. Thời gian để phôi phát triển qua 2 giai đoạn tế bào, giai đoạn phôi nang và