BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI TÁCH
CHIẾT ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO
CHIẾT TỪ CÂY XIDI KLUNG TẠI VƯỜN QUỐC GIA
BIDOUP – NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn :

ThS. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Phước

MSSV: 1211100297

:

Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng
như trong cuộc sống.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày..... tháng ..... năm.....
Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Phước


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC....................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v
DANH MỤC CÁC BẢNG.........................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ...............................................................................vii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN....................................................................................... 4
1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống..................................................... 4
1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên cây thuốc ............................................................ 4
1.1.2. Vai trò của cây thuốc dân gian .......................................................................... 4
1.1.3. Hoạt tính sinh học của cây thuốc ...................................................................... 6
1.2. Các thành phần hóa học từ thực vật ..................................................................... 7
1.2.1. Carbohydrate ..................................................................................................... 7
1.2.2. Alkaloid ............................................................................................................. 8
1.2.3. Glycoside......................................................................................................... 10
1.2.4. Tannin ............................................................................................................. 16
1.2.5. Steroid ............................................................................................................. 16
1.2.6. Amino acid ...................................................................................................... 17

2.2.3. Hóa chất, dung môi ......................................................................................... 44
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 45
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 46
2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu ............................................................ 46
2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật........................................... 46
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ............................................. 47
2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị................. 48
2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................... 49
2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ................................................ 49
2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC .................................... 51
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết ....................... 51
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................... 54
2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 55
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu
hồi cao chiết từ Xidi Klung ....................................................................................... 56

ii


Đồ án tốt nghiệp
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi tách chiết đến hoạt
tính kháng khuẩn của cao chiết. ................................................................................ 59
2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol
70% từ cây Xidi Klung đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. ................................ 62
2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết
ethanol 70% từ cây Xidi Klung................................................................................. 65
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 68
3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Xidi Klung từ các dung môi tách
chiết khác nhau.......................................................................................................... 68
3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung với các loại



Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DMSO: Dimethyl sulfoxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu
RNA: Ribonucleic acid
TSA: Trypton Soya Agar
TSB: Trypton Soya Broth

5


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất ..18
Bảng 1.2. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,
1999)............................................................................................... ...........................21
Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Xidi Klung từ các
loại dung môi khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh......................................81
Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70%
đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh .........................................................................85
Bảng 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Xidi Klung từ
ethanol 70%...............................................................................................................88

6


Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.21. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................................42
Hình 2.1. Mẫu Xidi Klung ngâm trong ethanol (tỷ lệ 1:20 (w/v))............................47
Hình 2.2. Phương pháp pha loãng mẫu ............................................................... ......49
Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế vi khuẩn của cao ethanol 70% và Ciprofloxacin
............................................................................................... ....................................50
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát..............................................................55
Hình 2.5. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Xidi Klung .............................56
Hình 2.6. Mẫu bột Xidi Klung ..................................................................................57
Hình 2.7. Dịch chiết mẫu từ cây Xidi Klung ngâm với ethanol 70% .......................58
Hình 2.8. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết .........................60
Hình 2.9. Giếng thạch trước và sau khi bổ sung cao ................................................61
Hình 2.10. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (100 mg/ml) đối với
chủng Staphylococcus aureus (A) và Samolnella enteritidis (B) .............................62
Hình 2.11. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ..........63
Hình 2.12. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (25 mg/ml) đối với chủng
Listeria monocytogenes ............................................................... ..............................64
Hình 2.13. Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol
70% từ cây Xidi Klung .............................................................................................65
Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ Xidi Klung với các dung môi khác nhau ..68
Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi
khác nhau và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ......................70
Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi
khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. .................................72
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi
khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ...........................74
8


Đồ án tốt nghiệp

khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh kể cả kháng sinh thế hệ mới. Bên cạnh đó, việc
phát triển các kháng sinh mới đã chững lại từ hơn 30 năm nay, trong khi tỷ lệ kháng
của vi khuẩn ngày càng gia tăng. Hậu quả của những việc trên là làm cho hiện
tượng kháng thuốc trở thành vấn đề mang tính toàn cầu và gia tăng nhanh ở các
nước đang phát triển. Trên thế giới, mỗi năm có hàng trăm ngàn người chết do
kháng thuốc và chi phí cho kháng thuốc lên đến hàng trăm tỷ USD. Điều đáng quan
tâm hiện nay là Việt Nam là nước sử dụng kháng sinh cao gấp 5 lần so với các nước
Châu Âu. Theo số liệu báo cáo của 15 bệnh viện trực thuộc Bộ Y, bệnh viện đa
khoa tỉnh ở Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh… về việc sử dụng
kháng sinh và kháng kháng sinh năm 2009 cho thấy có đến 30 – 70% vi khuẩn gram

1


âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4, gần 40 – 60% kháng với
aminoglycosid, fluoroquinolon và tình trạng kháng ngày càng tăng nhanh.
Để tìm ra giải pháp cho vấn đề kháng kháng sinh, ngày nay người ta bắt đầu
quay trở lại với thiên nhiên. Sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ
thực vật để thay thế dần các loại kháng sinh đã cấm sử dụng vì gây ảnh hưởng xấu
đến cơ thể con người. Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc được con người sử dụng
chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và truyền miệng từ đời này sang đời khác.
Do đó, hoạt tính trị liệu và độc tính của 1 số loại vẫn chưa được xác định cụ thể. Vì
thế, việc đánh giá hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của 1 số cây thuốc là
điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt
tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung tại vườn Quốc gia Bidoup –
Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa
Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ
Chí Minh.


1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống
1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên cây thuốc
Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả
nước là rừng núi. Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh
giá là nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16
trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật
phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị.
Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều
lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các
nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12 000 loài thực vật bậc cao, trong đó
khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện dược liệu, 2007). Nếu so với
khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây
thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú
nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhưng không có
kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các loài cây ngày càng ít đi. Thế
nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài
cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới
đem lại lợi ích cho con người nhưng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước
nhà.
1.1.2. Vai trò của cây thuốc dân gian
1.1.2.1. Trong y học
Cây thuốc được coi là di sản quý báu của dân tộc ta. Từ xa xưa, cây thuốc gắn
liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh.
Tuy chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con người nhưng chúng
được sử dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác
dụng phụ, độc hại cho người sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống.
Hiện nay, hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng được nghiên cứu và phát
triển nhiều hơn bởi các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang




trồng rừng với trồng cây thuốc ở những nơi có khí hậu và đất đai phù hợp sẽ làm
nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống, góp phần tích cực trong việc xoá đói giảm
nghèo cho người dân ở vùng núi (Trần Công Khánh, 2008).
1.1.3. Hoạt tính sinh học của cây thuốc
Cây cỏ là nguồn không thể thiếu của các sản phẩm tự nhiên sử dụng làm
thuốc, tác dụng chữa bệnh của chúng là do các hợp chất tự nhiên bên trong quyết
định. Các hợp chất thiên nhiên từ thực vật rất phong phú về mặt cấu trúc hóa học và
thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm như: kháng khuẩn, kháng sinh,
kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống sốt rét, điều hòa miễn dịch…
Hiện nay, thảo dược chủ yếu được sử dụng ở 2 dạng: một là trong hỗn hợp các
thành phần khác nhau (hỗn hợp tinh dầu, dịch chiết, dịch cô, chưng cất…), hai là sử
dụng các hoạt chất đơn lẻ. Các hoạt chất đơn lẻ được cho là thành phần có hoạt tính
chính trong thảo dược, chúng thể hiện hoạt tính rất cao, đặc hiệu nhưng yêu cầu liều
dùng và cách sử dụng chính xác. Còn các dịch chiết, hỗn hợp sẽ áp dụng cho các
loại thảo dược thể hiện dược tính thấp hoặc chưa phát hiện ra hoạt chất chủ yếu có
trong chúng.
Nhiều hoạt chất từ cây cỏ đã và đang được ứng dụng làm thuốc và được quan
tâm sản xuất ở nhiều nước như reserpin từ cây ba gạc (Rawofia serpantina (L.)
Benth. ex Kurz), quinidin, quinin tử cây canh ki na (Cinchona spp.)… Và gần đây,
nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chữa trị các bệnh hiểm nghèo (chống ung thư,
chống HIV, tăng cường miễn dịch cơ thể…) đã được phát hiện từ cây cỏ như taxol,
10-deacetyl baccatin từ loài thông đỏ (Taxus spp.), (+)-calanoid A và (-)-calanoid B
từ các loài mù u (Calophyllum lanigerum Miq., C. teysmanii Miq.), các nhóm chất
cucurmin từ chi nghệ (Cucurma L.) và rất nhiều hợp chất thiên khác có trong nhiều
loài thực vật.
Việt Nam có lợi thế nguồn tài nguyên thực vật phong phú, với khoảng 4000
loài cây được dùng làm dược liệu đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học
trong nước và trên thế giới. Do đó việc điều tra nghiên cứu hóa học và hoạt tính
sinh học của các loài cây thuốc có giá trị nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc phát

1.2.2. Alkaloid
1.2.2.1. Khái niệm
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có
phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Thông thường
các alkaloid kiềm không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại
các muối alkaloid thì dễ tan trong nước và hầu như không tan trong các dung môi
hữu cơ ít phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử
dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.
Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do
động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid có các tác
động dược lý học đối với con người và các động vật khác. Các alkaloid thông
thường là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng.
Chúng được tìm thấy như là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây
hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid có
thể được tinh chế từ các dịch chiết thô bằng phương pháp chiết acid - base (Tôn Nữ
Minh Nguyệt và ctv, 2010).
Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2
nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước,
tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm
anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở
dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid
cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay


không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh
Kỳ, 1998).
1.2.2.2. Phân loại
Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:
- Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin,
nicotin, spartein, pelletierin.

giúp chống ung thư (Vũ Xuân Tạo, 2013).
1.2.3. Glycoside
1.2.3.1. Khái niệm
Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường. Cấu tạo gồm 1 phần đường
(glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đường (aglycon) theo Vũ Kim Dung và
ctv (2011). Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside
dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong
cây.
Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol).
Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycoside phụ thuộc vào phần
aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị
hòa tan trong nước, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trưng (Trần Trường Hận, 2010).
1.2.3.2. Phân loại
Glycoside có 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu
liên kết giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011).

Hình 1.3. Sơ đồ phân loại glycoside


1.2.3.3. Vai trò
Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dưỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có
vai trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra một số
chất kháng khuẩn thường tập trung ở vỏ và hạt như độc tố Solanine ở khoai tây
(Trần Trường Hận, 2010).
Một số glycoside quan trọng:

Saponin
a. Khái niệm
Saponin là một glycoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật. Dưới
tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân

- Nhóm dimer (Ngô Văn Thu, 2011).
c. Vai trò
Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthraquinon glycoside có tác dụng
kích thích miễn dịch chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011).
 Cardiac glycoside
a. Khái niệm
Cardiac glycoside là các glycoside thực vật, bao gồm hai phần là phần
aglycone (không đường) và các glycine hay phần đường (Karkare, 2007). Cardiac
glycoside là những chất kết tinh, không màu, có vị đắng. Chúng tan trong các dung
môi phân cực và dễ bị thủy phân trong môi trường acid (Karkare, 2007).


b. Vai trò
Vai trò của cardiac glycoside:
- Ở nồng độ thấp: có tác dụng điều hòa nhịp tim.
- Ở nồng độ cao: gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy, giảm sức co bóp của
tim (Karkare, 2007).
 Flavonoid
a. Khái niệm
Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố
sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B
được nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid có màu
vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong thực
vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng như carotenoid,
anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011).
Chúng thường được cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) hoặc (-OCH3)
và thường ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất
phổ biến như flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone… Chỉ riêng hai
nhóm flavon, flavonone với các nhóm thế là OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể
gặp 38 627 chất (Ngô Văn Thu, 1998).