BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU
KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH1

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Tâm

MSSV: 1051110142

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan cuốn đồ án này là kết quả nghiên cứu của em, được tiến hành tại


Nguyễn Thị Tâm


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. vi
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.

Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
Mục đích của để tài ...................................................................................... 3
Mục tiêu, nhiệm vụ của đề tài ...................................................................... 3
Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3
Phương pháp xử lí số liệu ............................................................................. 3
Các kết quả đạt được của đề tài .................................................................... 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học ............................................... 5
2.1.1. Khái niệm và phân loại ....................................................................... 5

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 32
3.2. Vật liệu – môi trường – thiết bị sử dụng nghiên cứu ................................... 32
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 32
3.2.2. Môi trường ........................................................................................... 32
3.2.3. Hóa chất................................................................................................ 32
3.2.4. Dụng cụ ................................................................................................ 33
3.2.5. Thiết bị ................................................................................................. 33
3.3. Phương pháp luận ......................................................................................... 34
3.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 34
3.5. Phương pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng
SH1 ............................................................................................................... 38
3.5.1. Phương pháp quan sát hình thái sinh lý .............................................. 38
3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ Kit API 20E
.............................................................................................................. 39
3.5.3. Thử nghiệm hoạt tính enzyme.............................................................. 42
3.6. Phương pháp khảo sát môi trường nuôi cấy chủng Serratia marcescens
SH1 ............................................................................................................... 42
3.6.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường cơ bản Nutrient
broth ..................................................................................................... 43
3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia
marcescen SH1
.............................................................................................................. 44
3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
............................................................................................................... 45
3.7.

Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 ................... 46
3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của S. marcescensSH1
....................................................................................................... 47

marcescens SH1 ................................................................................... 63
4.3.5. Xây dựng đường cong tăng trưởng của S. marcescens SH1 trên môi
trường mới và điều kiện nuôi cấy mới ................................................. 65
CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ
5.1.
5.2.

Kết quả ............................................................................................................... 69
Kiến nghị ............................................................................................................ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 70
PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG
PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ

3


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens.................................... 15
Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia ............................................................ 16
Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập được từ các môi trường khác nhau............. 18
Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập được từ các môi trường
khác nhau....................................................................................................................... 18
Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh S. marcescens SH1 bằng bộ Kit API 20E................ 40
Bảng 3.2. Hàm lượng % nitơ tổng của các nguồn nitơ ................................................. 44
Bảng 3.3. Thành phần môi trường và các nguồn nitơ khảo sát..................................... 44
Bảng 3.4. Thành phần môi trường và các nguồn cacbon khảo sát................................ 45
Bảng 3.5. Tỉ lệ và mật độ giống khảo sát

................................................................. 48

Hình 4.6. Khả năng phân giải chitin ............................................................................. 55
Hình 4.7. Đường cong tăng trưởng của S. marcesces SH1 trên môi trường NB .......... 56
Hình 4.8. Ảnh hưởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ...
....................................................................................................................................... 57
Hình 4.9. Ảnh hưởng của các nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens
SH1................................................................................................................................58
Hình 4.10. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ..................... 60
Hình 4.11. Ảnh hưởng của Oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ................... 61
Hình 4.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1
....................................................................................................................................... 62
Hình 4.13. Ảnh hưởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của
S. marcescens SH1 ........................................................................................................ 64

5


Hình 4.14. Đường cong tăng trưởng của S. marcescens SH1 môi trường NB và môi
trường mới ..................................................................................................................... 65

6


CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Từ xa xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hằng ngày.

Các quá trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… đều ứng dụng các đặc
tính sinh học của các nhóm vi sinh vật. Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của

Nhưng hiệu quả chỉ được trong một thời gian ngắn. Sau đó, liều lượng do con người
pha ngày càng tăng, các loại sâu bệnh thì ngày càng thích nghi được và lại có một
cuộc tìm kiếm loại thuốc mới để diệt chúng. Vòng tuần hoàn này cứ tiếp tục, lâu
dần, hệ sinh thái nông nghiệp sẽ bị phá hủy và giết chết các loai thiên địch có ích và
làm ô nhiễm môi trường sống của con người cũng như các loài động vật khác.
Trước tình hình đó, các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương
pháp sinh học “thân thiện với con người và môi trường” được các nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu và cũng đã sản xuất được các loại sản phẩm xuất phát từ sinh
học. Việc sử dụng các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt
côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho cây trồng, cân bằng hệ sinh thái (các loài
thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng…) trong môi trường đất nói riêng và trong
môi trường sống nói chung mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các
thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác. Không gây ảnh hưởng tiêu cực
đến sức khỏe con người và cây trồng về trước mắt và cả lâu dài.
Do đó việc ứng dụng Serratia marcescens trong bảo vệ thực vật là một triển
vọng to lớn đối với nền nông nghiệp.
Bên canh đó vi khuẩn Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng sản
xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính
kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được
nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh
vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u
(D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000;
Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992;

2


Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Ngoài ra, prodigiosin còn có thể sử dụng để
tạo mùa tự nhiên trong nghành dệt may (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Dựa trên cơ sở những lợi ích quan trọng của chủng Serratia marcescens cũng


1.5.

Các kết quả đạt được của đề tài
-

Chọn được môi trường tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens
SH1.

-

Khảo sát được điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt
nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1.

1.6.

Kết cấu đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm có 5 chương:



Chương 1: Mở đầu
Chương 2: Tổng quan



Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3


hoặc dầu thực vật.
Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả
diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các
động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy,
do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc
trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu
sinh học.
Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi
trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc
với người và các sinh vật có ích. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh
học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và
sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do thời gian cách ly ngắn nên rất thích
hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn

5


có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc bảo vệ
thực vật sinh học.
2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu
Tuyến trùng sống trong đất có thể ký sinh trên côn trùng đất, nên chúng là
nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các thuốc trừ sâu vi sinh. Sau khi vào đất, tuyến
trùng phân tán và tấn công ngay côn trùng.
Tuyến trùng xâm nhập vào cơ thể côn trùng hoặc cùng thức ăn hoặc qua lỗ thở
và hậu môn côn trùng. Ở trong ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột đi vào
hệ tuần hoàn. Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng và phát triển khá nhanh, gây chết cho
côn trùng trong 1-2 ngày.
Trừ một số ít tuyến trùng sống được trong điều kiện khô dưới dạng bào nang,
còn hầu hết tuyến trùng hoạt động trong điều kiện có màng nước bao quanh. Vì thế,
tuyến trùng chỉ tác động đến các loài côn trùng sống trong đất, nơi chúng sống lâu



Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại
-

Clostridium brevifaciens

-

Clostridium malacosomae

-

Bacillus cereus

-

Bacillus thuringienis

-

Bacillus papillae.



Một số loài vi khuẩn không sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu
hại
-

Serratia marcescens

phụ thuộc vào hàm lượng của ion kali. Sự tác động này tạo lỗ hổng, cho phép lựa
chọn cation, làm tăng tính thấm của màng tế bào. Tính thấm nước tăng, tế bào bị
phồng lên thậm chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột giữa. Tính chọn lọc đặc trưng của các
chủng Bt với các loài côn trùng phụ thuộc vào cường độ các chất độc bao vây các
chất nhận. Ngoài ra, các bào tử của Bt trong ruột côn trùng cũng tiếp tục phát triển
và sản sinh ra tinh thể độc và bào tử mới, làm tăng hiệu lực của Bt.
Bt là thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; không có tác động tiếp xúc, xông
hơi và nội hấp. Vào trong cơ thể côn trùng, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan, huỷ
hoại các tế bào biểu mô (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng
ăn và tử vong.

8


2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh và tuyến trùng
Theo Gouge và Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) là những
động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được
gọi là “roundworms”. EPN có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt là côn
trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh
côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con
người, cây trồng và vật nuôi. EPN sống bên trong cơ thể vật chủ nên được
gọi là “nội ký sinh”. Chúng lây nhiễm cho rất nhiều loại côn trùng khác nhau
sống trong đất, bao gồm cả những dạng ấu trùng của bướm, ngài, bọ cánh cứng,
ruồi, dế trũi và châu chấu trưởng thành, ngay cả một số ấu trùng côn trùng có kích
thước nhỏ, có vòng đời ngắn như ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa. Tiêu biểu là hai
họ Steinernematidae và Heterorhabditidae hiện được sử dụng như một nhóm tác
nhân phòng trừ sinh học sâu hại rất có hiệu quả trên thế giới (Poinar, 1966). Cả 2
họ này được đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler và Kaya, 1990) và
với vi khuẩn cộng sinh trong ruột của chúng có khả năng gây ra nhiễm trùng huyết
cho ký chủ. Các vi khuẩn cộng sinh của chi Steinernema và Heterorhabditis


và

loài tuyến trùng này (Lysenko và

Weiser, 1974). Các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi,
Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P. fluorescens Biovar B và
Xanthomonas maltophilia

đã được tìm thấy liên

quan

đến

S.

scapterisci

(Aguilera và Smart, 1993; Aguilera và cộng sự, 1993). Ngoài ra, với chi
Heterorhadibditis đã được tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm
Providencia rettgeri (Jackson và cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi và O.
Intermedium (Babic và cộng sự, 2000).
Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, như S. liquefaciens, cũng
được phát hiện liên quan đến Steinernema spp. và Heterorhabditis spp. (Boemare
và cộng sự, 1997). Ngoài S. proteomaculans thì S. marcescens cũng được tìm
thấy trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006).
Mặc dù tất cả các nghiên cứu, báo cáo sự kết hợp của vi khuẩn không cộng sinh
với tuyến trùng EPN không có mô tả độc lực của các vi khuẩn liên quan, sự vận
chuyển vi khuẩn của tuyến trùng vào bên trong côn trùng, làm thế nào chúng được

2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết chết côn trùng
Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn
trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và
sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm.
Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp. và
Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội độc tố. Nội độc tố do X. poinarii sinh
ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào, các chất này gây độc đối với
huyết cầu (haemocytes) của côn trùng. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ
một mình nội độc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố
khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X. enorhabdus nhân nhanh số
lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng minh
trong P. Luminescens (Bowen và cộng sự, 1998) và X. Nematiphilus bằng cách tiêm
các dịch nuôi cấy vi khuẩn vào cơ thể côn trùng thì côn trùng sẽ chết nhanh chóng.

11


Các vi khuẩn này sản sinh các enzyme ra ngoài tế bào, các chất này chủ yếu là
protease, lipase, chitinase.
2.3.

Giới thiệu về Serratia marcescens

2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens
Serratia marcescens bắt nguồn từ sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn
thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về
“máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, năm 332 trước công nguyên,
những người lính của quân đội Macedonian của Alexander thấy rằng bánh mì
của họ đôi khi xuất hiện máu trên đó.
Năm 1800, Christian Gottfried Ehrenberg (1795–1876) phát hiện gần 100 tài

- Lớp: Gamma Proteobacteria
- Bộ: Enterobacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Chi: Serratia
- Loài: Serratia marcescens
2.3.3. Đặc điểm sinh lí
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, có đường kính
khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm (David R.C., 2012).

Hình 2.1. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)
0

Serratia marcescens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 5 - 40 C
và trong ngưỡng pH từ 5 - 9 .
Serratia marcescens có thể dễ dàng tìm thấy trong nước, đất, trên thực vật,
trong côn trùng, trong cơ thể người và động vật. Được tìm thấy nhiều trong thực

13


phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng
trưởng của S. marcescens.
S. marcescens có thể dễ dàng di động bằng tiên mao và tiêm mao. Chúng có
thể bám dính với nhau trên môi thạch thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 - 0,8%).
Các cụm tế bào có chiều dài từ 5 – 30µm . S. marcescens cũng có thể tạo thành
một màng sinh học. S. marcescens có thể phát triển trong sự hiện của oxy hoặc
trong trường hợp không có oxy. Chủ yếu sử dụng quá trình lên men để lấy
năng lượng, có các enzyme (superoxide dismutase, calatase và peroxides) bảo vệ
nó khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa.
2.3.4. Đặc điểm sinh hóa

7
8
9

ST Đặ Kết
T c
Di
độ
Ind
ole
Me
t
Vo
ges
Cit
rat
Dn
ase
Ca
tal
Ox
ida
Ur
eas
10 Ge
lati
11 Ch
itin
12 Tri Môi
ple tr

S. ureilytica
S. nematodiphila
S. glossinae
S. entomophila
S. plymuthica
S. odorifera
S. rubidaea
S. fonticola
S. ficaria
S. quinivorans
S. proteamaculans
S. grimesii
s. liquefaciens
S. marcescens
Đặc
đi

D
na
G
el
L
i
p
a
Li
pa
se
(c
S

+ + + + + + -

+ + + + -

+

+ + + + + + + + -

N
D
N
D

+ +

N
D

+ +

+ + + + + + + + + + +

N
D

N
D

V -


-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-


-

+ + +

+ + + + + -

+ -

-

+ + +

-

+ + + + + + + + + -

+ + -

-

-

-

V V V V V + + + + -

N
D
N
D

+ +

N
D

N
D

+ -

+ + +

+ + + + + + V + V + + -

+ +

Trong đó: ND: không xác định; V: phản ứng thay đổi

16