ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC,
MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata)
THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC,
MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata)
THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU

Ngành: Di truyền học
Mã ngành: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân

THÁI NGUYÊN - 2018

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018
Tác giả luận văn

Nguyễn Hải Yến

ii


MỤC LỤC
Trang


LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
1.1. Sơ lược về cây đậu Nho nhe .................................................................................. 3
1.1.1. Hệ thống phân loại .............................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe .................................................................. 3
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của đậu Nho nhe .......................................................... 3
1.1.4. Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe ........................................................................ 6
1.2. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật ............................... 7
1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu.......................................................... 10
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 37
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT............................................................................................. 37
TÀI LIỆU TIẾNG ANH ............................................................................................. 37

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

Amplified Fragments Length

4


AFLP
bp

Đa hình độ dài các đoạn khếch đại

Polymorphism
Base pair

Cặp bazơ nitơ

cDNA


Messenger RNA
Nicotinamide

NADP
PCR
RAPD

RFLP

ARN thông tin
adenine Coenzym được sử dụng trong phản

dinucleotide phosphate

ứng đồng hóa

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuôi polymerase

Random Amplification

Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên

of Polymorphic DNA
Restriction Fragment Length
Polymorphism

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR nhân vùng gen ITS ......................................... 22
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái hạt của 02 mẫu đậu Nho nhe ...................................... 24
Bảng 3.2. Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của 2 mẫu đậu
Nho nhe.................................................................................................... 28
Bảng 3.3. Đặc điểm hóa sinh của 02 mẫu đậu Nho nhe ....................................... 30
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS từ
mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS
trên GenBank ........................................................................................... 34


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang


Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ glucosamine theo phương pháp Miller.................. 17
Hình 2.2. Đường chuẩn nồng độ tyrosine .................................................................. 19
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái thân, lá (A), hoa (B), quả (C) và hạt (D) của mẫu
đậu Nho nhe ............................................................................................. 23
Hình 3.2. Giải phẫu lá của đậu Nho nhe .................................................................... 25
Hình 3.3. Giải phẫu thân của đậu Nho nhe ................................................................ 26
Hình 3.4. Giải phẫu rễ của đậu Nho nhe .................................................................... 26
Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm
3 ngày tuổi ............................................................................................... 29
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số .......................... 30
Hình 3.7. Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN01-YB (A) và NN10-LC (B).........
31
Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu đậu
Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với một số trình tự vùng
ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI................................. 32
Hình 3.9. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A)

sánh hình thái, nghiên cứu sẽ tiến hành đánh giá sự đa dạng ở mức độ DNA và mối
quan hệ di truyền giữa các bộ giống nghiên cứu để làm cơ sở bước đầu phát hiện khả
năng trùng lặp mẫu giống trong tập đoàn đậu Nho nhe; đồng thời phục vụ công tác
bảo tồn, khai thác các nguồn gen đậu Nho nhe địa phương, tiến tới ứng dụng chọn tạo
các giống đậu Nho nhe mới phù hợp với nhu cầu thực tiễn.

1


Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm
thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thu tại tỉnh
Yên Bái và Lai Châu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích và so sánh được đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và trình tự
vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Xác định và so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu cây đậu Nho nhe
thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu.
(2) Xác định đặc điểm hóa sinh liên quan tới hàm lượng protein tan, hoạt tính
α-amilase, protease và hàm lượng isoflavone của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh
Yên Bái và Lai Châu.
(3) Phân lập và xác định được trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe
thu được.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây đậu Nho nhe
1.1.1. Hệ thống phân loại

gen của từng giống và dao động từ 10,32-11,81% [24].
Protein tổng số: Hàm lượng protein tổng số được xác định là hàm lượng nitơ
tổng số có trong các nhóm amin của axit amin và vòng dị vòng của histidine,
tryptophan, proline và hàm lượng hydroxyproline. Kochhar và Hira (1997) đã phân
tích giá trị dinh dưỡng của các giống đậu Nho nhe Vigna radiata và chỉ ra hàm lượng
protein thô dao động từ 18,12-26,87% [18]. Tiếp theo là nghiên cứu của Saikia và
đồng tác giả (1999) đã chỉ ra sự thay đổi hàm lượng protein trong các mẫu đậu Nho
nhe dao động từ 16,91-18% [27]. Chất lượng dinh dưỡng của 17 loài đậu Nho nhe đã
được Srivastava và đồng tác giả (2001) xác định. Hàm lượng protein thô thay đổi từ
20,34-22,97% [28]. Năm 2002, Khabiruddin và đồng tác giả đã phân tích các loài đậu
khác nhau thể hiện đặc điểm hóa sinh khác nhau. Sự thay đổi hàm lượng protein tổng
số trong hạt chín khô của đậu Nho nhe thay đổi từ 15,83-19,01% [17]. Sadana và
đồng tác giả (2006) đã xác định 14 mẫu đậu Nho nhe và chỉ ra hàm lượng protein
tổng số giao động từ 17,33-19,92% [24]. Các dữ liệu về năng suất, chất lượng và giá
trị bổ sung của các giống đậu Nho nhe đã được Raiger và đồng tác giả (2010) nghiên
cứu. Hàm lượng protein tổng số trong các giống đậu Nho nhe được trồng tại các địa
điểm khác nhau ở Ấn Độ đạt từ 17,52-21,02% [22]. Trong khi, Katoch (2011) đã xác
định 30 dòng đậu Nho nhe liên quan tới các đặc tính sinh lý và dinh dưỡng; đã chỉ ra
hàm lượng protein thay đổi từ 16,14-19,13% [16]. Như vậy, hàm lượng protein trong
hạt đậu Nho nhe giữa các giống là khác nhau.
Chất béo tổng số: Thực phẩm thuộc cây họ đậu gồm đậu Nho nhe có chứa một
lượng lớn chất béo không nhìn thấy. Tuy nhiên, thông tin thích hợp liên quan đến sự
thay đổi thông số này đã được xem xét trên quan điểm chế độ ăn giống nhau. Năm
1991, Gopalan và đồng tác giả đã báo cáo về giá trị chất béo tổng số dao động từ
0,14-5,63% ở các mức tiêu thụ thông thường ngoại trừ đậu tương. Trong khi hàm
lượng chất béo trong các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 3,46 -4,03% [12].
Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 mẫu đậu Nho nhe và xác định
hàm lượng chất béo dao động từ 1,97 -3,73% [28]. Trong khi, báo cáo về hàm
lượng chất béo của Sharma (2002) là 0,83% [27]. Năm 2011, Katoch đã phân


g/16gN và 0,85-2,42 g/16gN [16].
Hàm lượng tanin: Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 giống đậu
Nho nhe liên quan đến các yếu tố dinh dưỡng và phi dinh dưỡng. Kết quả nhận thấy,

5


hàm lượng polyphenol đạt từ 0,08-0,16% [28]. Năm 2002, Khabiruddin báo cáo sự
thay đổi hàm lượng phenolic trong 15 giống đậu Nho nhe dao động từ 0,36-1,78%
[17]. Saharan (2002) đã nghiên cứu các thông số lý hóa của các giống đậu tằm và đậu
Nho nhe có năng suất cao. Nghiên cứu chỉ ra sự thay đổi hàm lượng polyphenol dao
động từ 750-1698 mg/100g [25]. Priya (2005) đã xác định được tannin đặc có trong
30 giống đậu Nho nhe. Hàm lượng tannin đặc được xác định từ 26-105 mg/100g. Dữ
liệu được trình bày trong báo cáo thường niên của AICRN về các loại cây trồng đến
năm 2010 nhận thấy, hàm lượng tannin tổng số trong các giống đậu Nho nhe dao
động từ 510-625 mg/100g [21].
Hàm lượng khoáng: Trong hạt đậu Nho nhe có chứa một số nguyên tố khoáng
như canxi, sắt, kẽm. Hàm lượng của các nguyên tố khoáng này phụ thuộc vào từng
giống đậu Nho nhe khác nhau. Sadana và đồng tác giả (2006) xác định hàm lượng
canxi và kẽm có trong hạt đậu Nho nhe lần lượt đạt từ 0,27-0,35% và 2,19-3,39
mg/100g [24]. Năm 2010, Raiger và đồng tác giả đã xác định được hàm lượng canxi,
sắt và kẽm trong các giống đậu tương khác nhau trồng tại Ấn Độ lần lượt đạt từ 307379; 3,87-8,95 và 2,55-4,30 mg/100g [22].
1.1.4. Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe
Các loài cây họ đậu là nguồn cung cấp protein rẻ, giàu dinh dưỡng và chất
lượng cao; có thể được thay thế cho protein động vật. Các loài cây họ đậu cũng tạo ra
các chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng như dược phẩm, chất dinh dưỡng và các sản
phẩm phụ thân thiện với sinh thái như tannin, nướu, thuốc sát trùng, nhựa, véc ni,
sơn, thuốc nhuộm và dầu diesel sinh học. Ngoài ra, các loài cây họ đậu còn được sử
dụng làm thức ăn cho động vật. Các loài cây họ đậu còn góp phần phát triển nền nông
nghiệp bền vững: chúng làm giàu nitơ trong đất thông qua các vi khuẩn cộng sinh và

phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt
được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa
học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép
chúng ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài
sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó, sinh vật có thể
được định danh và được xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể
hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA
sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật khác
một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ
hô trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã

7


vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối
quan hệ di truyền giữa các loài.
Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của
sinh vật như một chuôi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau.
Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có chức năng,
nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã. Cấu trúc vùng ITS
gồm ITS1-5,8S-ITS2. Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và
nhanh chóng phân hủy. Lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1
và ITS2) được nối với nhau qua locus 5,8S. Vùng 5,8S khá bảo thủ, trên thực tế có đủ
tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành. Do đó các locus 5,8S có thể phục
vụ như là một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài
và nhận diện. Tiện ích của vùng bảo thủ như 5,8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở
dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [27].
Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây
thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys
(UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của gen

DNA. Trong đó, việc kết hợp giữa gen rbcL và matK đã được đề xuất là mã vạch
thực vật ưa thích [19]. Giống như gen rbcL và matK, các nghiên cứu chứng minh các
vùng gen ITS có tiềm năng trong phân loại các loài thực vật, trong đó có các loài
thuộc chi Vigna.
Năm 2015, Raveendar và đồng tác giả đã sử dụng vùng gen ITS2 và gen matK
để phân loại các loài thuộc chi Vigna. Kết quả cho thấy, trong tổng số 298 trình tự từ
52 loài Vigna trong nghiên cứu, đã xác định tỉ lệ 4 loại nucleotit lần lượt là
A=23,3±1,5%, T=25,4±4,7%, G=28,5±1,6%, C=22,8±3,4%; chiều dài của vùng gen
ITS2 là 413 nucleotit và gen matK là 469 nucleotit. Sử dụng vùng gen ITS2 và gen
matK chia 52 loài thành 6 nhóm: nhóm I (gồm các loài và dưới loài của V.
friesiorum), nhóm II (các loài của V. membranacea), nhóm III (loài V. schimperi),
nhóm IV (các loài V. unguiculata, V. radiate, V. lobatifolia, V. angivensis, V.
vexillata), nhóm V (gồm các loài V. hosei, V. racemose, V. fischeri, V. oblongifolia,
V. marina, V. luteola) và nhóm VI gồm những loài còn lại [23].
Chen và đồng tác giả (2016) đã sử dụng chỉ thị maker SSR để xác định các loài
đậu Nho nhe Vigna umbellata L. Trong nghiên cứu này, khoảng 26 triệu trình tự
cDNA từ các loài đậu Nho nhe đã được xác định và được lắp ráp thành 71929 trình tự
có chiều dài trung bình khoảng 986 bp. Trong số các trình tự này có 38840 trình tự có

9


sự tương đồng protein và trình tự nucleotit với các trình tự trên NCBI; 3018 trình tự
đã được xác định là chỉ thị SSR tiềm năng trong phân loại các loài V. umbellate [10].
Năm 2004, Ba và đồng tác giả đã sử dụng chỉ thị RAPD để xác định 26 giống đậu
nho nhe (5 giống thuần chủng và 21 giống địa phương) từ Tây, Đông và Nam Phi. 28
cặp mồi được sử dụng để nhân dòng cho 202 băng; trong đó có 180 băng thể hiện sự
đa hình giữa các giống thuần chủng/181 giống địa phương. Kết quả chứng minh được
các giống địa phương có sự đa dạng hơn so với các giống thuần chủng [9].
Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng

cây đậu tương tại 6 vùng thu thập mẫu nấm ở Việt Nam là loài nấm có giai đoạn sinh
sản vô tính thuộc chi Oidium sp. và xác định được 8 mẫu giống kháng cao; Đã xác
định được hệ số tương đồng di truyền giữa 34 giống đậu tương dao động trong
khoảng 0,1-0,74 và chỉ ra 3 chỉ thị có liên kết với gen kháng bệnh phấn trắng; Đã
chọn được 12 dòng đậu tương triển vọng và khảo nghiệm 2 giống kháng bệnh phấn
trắng và năng suất đạt 25,36-26,64 tạ/ha [7].
Hướng nghiên cứu về đa dạng di truyền: Phạm Thị Ngọc và đồng tác giả (2016)
đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu cô ve bằng chỉ thị
hình thái và chỉ thị phân tử SSR của 60 mẫu giống đậu cô ve thu thập trong nước và
nhập nội dựa trên chỉ thị hình thái (đặc điểm thực vật học, nông sinh học) và chỉ thị
phân tử SSR. Kết quả phân tích đa dạng di truyền dựa trên 16 chỉ thị hình thái đã
phân chia các mẫu giống đậu cô ve thành 7 nhóm với hệ số tương đồng là 0,17. Sử
dụng 20 chỉ thị SSR, kết quả phân tích PCR trên các mẫu giống của nghiên cứu, chỉ
có 15 chỉ thị xuất hiện băng DNA đa hình và 5 chỉ thị không xuất hiện băng DNA là:
BM188, BMd-1, GATS91, C33 và C106. Kết quả thu được tổng số 69 allen đa hình,
trong đó chỉ thị BM152 có hệ số đa dạng cao nhất là 0,73. Dựa trên kết quả phân tích
ma trận đồng hình, các mẫu giống đậu cô ve có hệ số tương đồng di truyền dao động
từ 0,57-1. Kết quả chứng tỏ các mẫu giống đậu cô ve thu thập có sự đa dạng cao về
mặt di truyền. Nếu mức tương đồng di truyền là 0,69 có thể chia 60 mẫu giống thành
4 nhóm di truyền. Kết quả của nghiên cứu thể hiện khả năng ứng dụng cao của chỉ thị
SSR trong phân tích đa dạng di truyền đối với nguồn gen đậu cô ve. Phân tích đa
dạng 60 mẫu giống làm cơ sở lựa chọn mẫu giống cho chương trình chọn giống đậu
cô ve cho các mục đích khác nhau [4].
Năm 2007, Nguyễn Thị Lang đã sử dụng 30 giống đậu nành từ ngân hàng gen
của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu và đánh giá đa dạng nguồn
gen. Dùng hai loại chỉ thị phân tử (chỉ thị RAPD và SSR), được thiết lập giữa các

11



tương [6].

12