ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)
Ngành Công nghệ sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài. .......................................................................................... 1
2 Mục đích nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo .............................................................. 4
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo .................................................................... 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.4. Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ........................................ 6
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.................................. 7
1.2.1 Giá trị dược liệu ....................................................................................... 7
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................. 11
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris ......................................................................................... 13
1.3.1. Vai trò của giống. .................................................................................. 13
1.3.2. Yếu tố dinh dưỡng................................................................................. 14
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể
nhân tạo thể rắn ............................................................................................... 15
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................... 16
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 16
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trên Thế gới ....................................................... 19


iii
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 21
2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ................................................. 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 21

nhân tạo. .......................................................................................................... 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
4.1 Kết luận ..................................................................................................... 53
4.2 Đề nghị ...................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55


v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BE

:

Biological efficiency

ĐC

:

Đối chứng

ĐTHT

:

Đông trùng hạ thảo

PDA


sợi nấm Đông trùng hạ thảo ............................................................................ 34
Bảng 3.3: bảng tổng hợp đánh giá khả năng thích nghi của hệ sợi nấm trên các
loại cơ chất giá thể khác nhau. ........................................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các cơ chất gạo đến sự hình
thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học .............................. 36
Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn carbon tới năng suất nuôi
trồng nấm Đông trùng hạ thảo ........................................................................ 40
Bảng 3.6: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn carbon tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 41
Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn ni to khác nhau tới năng
suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ......................................................... 44
Bảng 3.8: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 45
Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng khác nhau tới năng
suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ......................................................... 48
Bảng 3.10: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn muối khoáng tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 49
Bảng 3.11: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng 50
Bảng 3.12: Ma trận kết quả mối tương quan giữa các yếu tố dinh dưỡng tới
năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ................................................ 51


vii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên . ................................................... 4
Hình 1.2 Phân loại nấm Cordyceps ................................................................... 5
Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo........................... 6
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo ......................... 30
Hình 3.1: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên các môi trường nhân giống cấp

của chúng bắt nguồn từ những quan sát thực tế: vào mùa Đông bào tử nấm xâm
nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể nấm
mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống một loại thực vật (Hạ
thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.
Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nước phát
triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị dược lý của đông trùng hạ thảo. C.
militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể:
Cordycepin có tác dụng ức chế sự phân hạch và trì hoãn sự lây lan của các tế
bào ung thư (Khan, Tania et al. 2010); Adenosine được chứng minh có tác
dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch; Mannitol có tác dụng làm tăng độ
thẩm thấu của huyết tương và dịch trong ống thận, gây lợi niệu thẩm thấu và
làm tăng lưu lượng máu thận; Superoxide dismutise để phòng ngừa và điều trị
xuất huyết não, viêm loét, loại bỏ tình trạng viêm, loạn nhịp tim, phù nề, nhiễm
độc, bệnh thấp khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương bức xạ,
nhiễm độc thuyên tắc. Ngoài ra, trong dịch chiết Đông trùng hạ thảo còn chứa
chứa nhiều loại vitamin và acid amin thiết yếu cho cơ thể.
Do có công dụng tốt nên nhu cầu sử dụng ĐTHT ngày càng tăng cao,
trong khi đó nguồn cung cấp từ tự nhiên mỗi năm chỉ đáp ứng được m nhu
cầu thị trường. Bên cạnh đó, hoạt động khai thác quá mức có thể khiến loài
nấm này có nguy cơ bị tuyệt chủng. Trước tình hình đó, các nhà khoa học trên
thế giới như đã tiến hành nghiên cứu nuôi ĐTHT trên môi trường nhân tạo.
Trong các loài thuộc chi Cordyceps, Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris
là hai loài phổ biến và được nghiên cứu nhiều hơn cả. Các hướng nghiên cứu


2
hiện nay chủ yếu theo ba con đường: Một là ĐTHT được nuôi trên ký chủ côn
trùng, mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn chưa đáp ứng được ở quy
mô công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao. Hai là, nuôi cấy ĐTHT trên
môi trường dịch lỏng với mục tiêu là nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp hoạt



4
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo
Đông trùng Hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng
những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh
phấn thuộc chi Thitarodes. Tên gọichúng xuất phát từ quan sát thực tế: vào
mùaĐông bàotử nấm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấutrùng (Đông trùng),
đến mùahè quả thể nấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông
gi
ống một loạithực vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên .
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại
ĐTHT trong tự nhiên được phát hiện chủ yếu ở một số cao nguyên của
Nepal, Ấn Độ, Trung Quốc và Bhutan…, trung bình các cao nguyên này có
độ cao từ 3500m đến 5000m so với mặt nước biển. Dựa trên đặc điểm hình
thái cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, Đông trùng hạ thảo được xếp vào
phân giới nấm (Fungi), ngành nấm túi (Ascomycota), lớp Sordariomycetes,


5
bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps, bao gồm 400 loài đã
được phát hiện, tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ tập trung nghiên cứu 2
loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với
con người.


cấp một mặt không ngừng phát triển để tạo hệ sợi thứ cấp, một mặt tiếp tục
xâm nhập vào cơ thể côn trùng sử dụng nguồn dinh dưỡng trong cơ thể côn
trùng. Kết thúc giai đoạn sinh trưởng, các hệ sợi thứ cấp được liên kết với nhau
tạo thành một khối thồng nhất gọi là quả thể nấm. Quả thể nấm có màu vàng
cam hoặc cam hồng dài khoảng từ 2 – 8 cm. Quả thể nấm tiếp tục phát triển


7
đến giai đoạn thành thục và phát tán bào tử bắt đầu chu kì sinh trưởng và phát
triển mới.
So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi trồng dễ hơn trong
môi trường nhân tạo. Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như
là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có hoạt tính sinh
học và tính chất dược liệu tương tự nhau. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cũng
đã chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa nhiều loại thành phần có hoạt
tính sinh học như cordycepin, ergosterol, mannitol và polysaccharides....
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
1.2.1 Giá trị dược liệu
 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền
Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của
Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y. Theo y học cổ truyền của
Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các
chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn
tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B
mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục...
Những năm gần đây, các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh được
những công dụng chữa bệnh và bồi bổ cơ thể mà các nhà Y học cổ truyền đã
sử dụng do các hoạt chất sinh học quý trong quả thể nấm: Cordycepin (3’deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động
kháng virus (Zhou, Meyer et al. 2002); Adenosine được cho là có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch (Tsai, Lin et al. 2010); Mannitol cũng có

Một số hoạt chất quan trọng mang giá trị dược liệu
Cordycepin (3'-deoxyadenosine)
Cordycepin là thành phần hoạt chất chính có trong quả thể Cordyceps
militaris, được phát hiện lần đầu tiên từ Cordyceps militaris và sau đó tìm
thấy có mặt trong Cordyceps sinensis (Cunningham, Manson et al. 1950) và
Cordyceps kyushuensis (Ling JY, Sun YJ et al. 2002).
Theo Khan và cộng sự (2010), Cordycepine trong ĐTHT có khả năng ức
chế sự phát triển của khối U, tăng thời gian sống cho những con chuột được
cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự di căn của tế bào ung thư
(Asaduzzaman Khan, Mousumi Tania et al. 2010). Dịch chiết từ nấm ĐTHT
ức chế sự phát triển của tế bào máu từ cuống rốn (HUVEC), dòng tế bào mô
mềm Sarcoma gây ung thư ác tính HT180. Dịch chiết của nấm này cũng giảm
metalloproteinase 2(mmp2) biểu hiện gen trong tế bào HT1080. Mới đây
người ta cũng đã phát hiện ra một emzym phân giải protein từ các quả thể khô
của Cordyceps militaris có khả năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và
ung thư bàng quang.


9
Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại
quá trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư. Trong một nghiên
cứu Park et al. (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng
trưởng tế bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của
tế bào hoặc làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự
chết của tế bào) (Park, Na et al. 2009). Một nghiên cứu khác cũng chứng
minh khả năng ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào của nước chiết
nấm Cordyceps militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594.
Adenosine (C10H13N5O4)
Nucleotides (bao gồm adenosine, uridine, cytidine, uracil và guanosine)
là các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris (Kredich NM and

Ergosterol là sterol duy nhất có trong nấm và là một tiền chất quan trọng
của vitamin D2, nó có giá trị chữa bệnh quan trọng (Peterson RRM 2008).
Lovastatin
Lovastatin, một trong những chất chuyển hóa thứ cấp trước đây tìm thấy ở
các loài nấm mốc thuộc chi Monascus, là một 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzym A xúc tác trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol và đã được
chứng minh là có hiệu quả chống viêm, chống oxy hóa, và tính profibrinolytic
và để ngăn chặn hội chứng mạch vành cấp tính và bệnh xơ vữa động mạch
(Aarons CB, Cohen PA et al. 2007).
GABA
GABA là một trong những chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong hệ
thống thần kinh trung ương và ức chế dẫn truyền thần kinh giao cảm ngoại
biên. Một vai trò quan trọng đối với GABA ở cả điều khiển hệ thống thần
kinh trung ương và ngoại vi đến huyết áp đã được chứng minh (Suzuki R,
Maehara R et al. 2012).


11
GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần
kinh chẳng hạn như bệnh đa xơ cứng (Carmans S, Hendriks J et al. 2013).
Ergothioneine
Ergothioneine là một dẫn xuất histidine với lưu huỳnh vào vòng
imidazole và amin trimethylated (Turner E, Klevit R et al. 1986).
Nhiều thử nghiệm cho thấy đây là chất chống oxy hóa và có khả năng
hoạt hóa các tế bào chống lại một loạt các yếu tố gây stress tế bào (Cheah I
and Halliwell B 2012)
Ergothioneine đã được chứng minh là chất tác dụng ngăn ngừa bức xạ và
dọn dẹp các gốc tự do, các gốc hydroxyl, axit hypochlorous, và các gốc
peroxyl cũng như để ức chế nitrat peroxynitrite vào các protein và DNA
(Dubost NJ, Beelman RB et al. 2007).
Tuy nhiên, ergothioneine là hầu như chỉ được sản xuất bởi nấm và một số


0,36

Serine

3,13

0,39

Glutamic

8,79

1,40

Glycine

1,84

0,52

Histedine

1,84

0,46

Arginine

5,29


0,65

Methionine

0,18

0,07

Lysine

15,06

2,20

Isoleucine

1,16

0,35

Leucine

1,43

0,46

Phenylalanine

1,15


33,0

Adenosine (%)

0,18

0,06

Cordycepin (%)

0,97

0,36

Acid béo (%)


13
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ
thảo Cordyceps militaris
1.3.1. Vai trò của giống.
Quả thể nấm được sinh ra cần phải có các điều kiện cần và đủ, đó là
giống nấm và cơ chất có nguồn carbon. Trong đó, giống nấm là yếu tố quyết
định đến sản lượng và chất lượng của nấm làm ra. Một giống khỏe mạnh sẽ
sinh trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau và có khả năng
hình thành quả thể tốt. Mỗi giống lại có một khoảng thời gian sử dụng nhất
định, vượt qua ngưỡng thời gian này sức sinh trưởng của nấm sẽ giảm, giống
bị suy thoái. Một số dấu hiệu của giống thoái hóa bao gồm: giảm tỷ lệ sinh
trưởng, mật độ hệ sợi thấp, năng suất thấp hoặc hình thái quả thể bị biến

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy những nguồn carbon có thể sử
dụng để nuôi trồng nấm ĐTHT là các loại đường, tinh bột… trong đó thích
hợp nhất là những loại có cấu trúc phân tử nhỏ (Shrestha et al., 2012)
1.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng ni tơ
Ni tơ là nguyên tố bắt buộc để tổng hợp acid nucleic và protein cấu trúc
nên tế bào. Dinh dưỡng ni tơ có thể được lấy từ nguồn ni tơ hữu cơ tự nhiên,
nguồn ni tơ tổng hợp, nguồn ni tơ vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni.
Theo Gao et al. (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng
ni tơ tương đối thấp. Nếu hàm lượng ni tơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm
chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể
1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Một số muối khoáng như K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/l có thể
làm tăng năng suất quả thể. Một vài nguyên tố có thể làm tăng hoạt chất sinh
học của Cordyceps militaris (Dong et al., 2012).


15
1.3.2.4. Các loại vitamin
Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris. Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin
cần thiết, vì vậy trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm
lượng vitamin nhất định
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá
thể nhân tạo thể rắn
Do có chứa nhiều hoạt chất sinh học quý: cordycepin, adenosin,
polysaccharides, ergosterol và mannitol nên từ lâu ĐTHT được coi là một
loại thảo dược quý, có nhiều giá trị dược liệu trong việc hạ đường huyết,
chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch,
chống oxi hóa, tăng hoạt lực của tinh trùng. Tuy nhiên, ĐTHT trong tự nhiên
sản lượng rất ít nên để tìm kiếm và sử dụng ĐTHT tự nhiên làm dược phẩm

Ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt
được một số kết quả. Việc nghiên cứu mang tính chất điều tra, phát hiện, thu
thập và bước đầu phân lập chúng trong điều kiện Việt Nam.
Nghiên cứu về thành phần loài:Trịnh Tam Kiệt (1996) đã nêu danh mục
các loài nấm Đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam thuộc họ Clavicipitaceae có 3
loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps martialis Speg., Cordyceps sinensis
và loài Cordyceps sobolifera. Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông trùng hạ thảo
có phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên
Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội,
Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng,
Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh (Trịnh Tam Kiệt 1996).
Năm 2009, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học
Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT ( Cordyceps nutans )
tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang