ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG LỎNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN HỆ SỢI VÀ HÀM LƢỢNG CORDYCEPIN
CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2013-2017

Thái Nguyên, năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN


: 1. TS. Dƣơng Văn Cƣờng
: 2. ThS. Đỗ Tuấn Bách

Thái Nguyên, năm 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em
đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng thành phần môi
trƣờng lỏng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin của nấm
Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Khoa học
sự sống – Đại học Thái Nguyên, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong
Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS. Dƣơng Văn Cƣờng,
ThS. Đỗ Tuấn Bách, ThS. Ma Thị Trang và KS. Vũ Hoài Nam đã tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời
đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017
Sinh viên




iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Nấm Cordyceps militaris ................................................................... 6
Hình 2.2: Các dạng bào tử trong chu trình sống của nấm.................................. 7
Hình 2.3: Công thức hóa học của cordycepin và adenosine ............................ 12
Hình 4.1. Bình giống sau 10 ngày nuôi cấy trên các công thức môi
trƣờng khác nhau .............................................................................. 27
Hình 4.2: Hàm lƣợng cordycepin của hệ sợi trên các công thức môi
trƣờng lỏng........................................................................................ 29
Hình 4.3: Hàm lƣợng cordycepin của dịch lỏng trong một bình trên các
công thức môi trƣờng lỏng ............................................................... 30
Hình 4.4: Bình giống sau 10 ngày nuôi cấy trên các nồng độ pH khác
nhau. .................................................................................................. 32
Hình 4.5: Khối lƣợng hệ sợi trên các nồng độ pH khác nhau.......................... 33
Hình 4.6: Hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi trên các nồng độ pH khác
nhau ................................................................................................... 34
Hình 4.7: Tổng hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi trên các nồng độ pH
khác nhau .......................................................................................... 35
Hình 4.8: Hàm lƣợng cordycepin của dịch lỏng trong một bình trên các
nồng độ pH khác nhau ...................................................................... 36


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ĐTHT

: Đông trùng hạ thảo


: Standard error


v
MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ......................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................ 2
1.2.1 Mục tiêu tổng quát ............................................................................... 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn................................................................ 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................ 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài................................................................. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
2.1. Giới thiệu................................................................................................ 4
2.1.1. Giới thiệu Đông Trùng Hạ Thảo ......................................................... 4
2.1.2. Nấm Cordyceps militaris .................................................................... 5
2.1.3. Thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris ............................. 8
2.1.4. So sánh hai phƣơng thức nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng và môi
trƣờng rắn của nấm Cordyceps militaris ..................................................... 15
2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi
trƣờng lỏng trong và ngoài nƣớc ................................................................. 15
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 15
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc...................................................... 18
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .. 19
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu ..................................... 19

lƣợng cordycepin trong dịch lỏng ............................................................... 36
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................... 40
5.1. Kết luận ................................................................................................ 40
5.2. Kiến nghị .............................................................................................. 40


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm dƣợc liệu đã đƣợc biết đến từ hàng ngàn năm nay đƣợc sử dụng
hoặc nghiên cứu và điều trị bệnh. Hơn hai phần ba số ca tử vong liên quan
đến ung thƣ có thể đƣợc ngăn ngừa hoặc giảm đi bằng cách bổ sung nấm vào
trong khẩu phần ăn [24]. Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều
dạng môi trƣờng sống khác nhau, kể cả sa mạc. Đa phần các nấm đều không
thể nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất
mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động, thực vật [1].
Những loại nấm nhƣ nấm Hƣơng, nấm Chaga, nấm Linh chi, nấm phục linh,
nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc tập trung nghiên cứu bởi khả năng chống
ung thƣ, chống virus và tăng cƣờng hệ miễn dịch [1].
Đông trùng hạ thảo (ĐTHT - tên khoa học Cordyceps) là tên gọi chung
chỉ những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bƣớm
thuộc chi Thitarodes. Vào mùa đông nấm xâm nhiễm vào cơ thể ấu trùng ẩn
dƣới mặt đất, vào mùa hè với nhiệt độ vào độ ẩm thích hợp, hệ sợi nấm phát
triển thành cây nấm nhú lên trên mặt đất. Trong Cordyceps, có rất nhiều thành
phần quan trọng bao gồm các loại acid amin thiết yếu, vitamin: B1, B2, B12
và K, các loại carbohydrate khác nhau nhƣ monosaccharide, oligosaccharides
và các polysaccharide, protein, sterole, nucleoside và các nguyên tố vi lƣợng
khác [24]. Quả thể nấm còn chứa nhiều axit amin khác nhƣ lysine, glutamic
acid, proline và threonine. Hoạt chất chính trong Cordyceps là cordycepin và

triển của hệ sợi và đạt tổng hàm lƣợng cordycepin cao nhất.


3
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Quá trình nghiên cứu sẽ đƣa ra đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần môi
trƣờng, độ pH của môi trƣờng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng
cordycepin của nấm Cordyceps militaris.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu là căn cứ khoa học giúp cho việc hoàn thiện quy
trình nuôi trồng nấm C. miltaris trên môi trƣờng lỏng để sản xuất cordycepin
- Mở ra hƣớng ứng dụng sản xuất cordycepin trên quy mô công nghiệp.
- Tạo ra sản phẩm nấm ĐTHT có chất lƣợng đảm bảo với chi phí hợp lý.
- Thúc đẩy phong trào nghiên cứu khoa học của sinh viên Khoa CNSHCNTP và nhà trƣờng


4
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu
2.1.1. Giới thiệu Đông Trùng Hạ Thảo
Nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là các loài nấm thuộc ngành phụ nấm
túi Ascomycetes ký sinh trên cơ thể côn trùng, đƣợc xem nhƣ là một dƣợc
liệu nổi tiếng từ cổ xƣa. Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại
trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại các loài này đƣợc xếp vào
họ Clavicipitaceae. Dựa trên đặc điểm hình thái cũng nhƣ đặc điểm về cấu
trúc phân tử, các loài nấm trên đƣợc xếp trong 162 đơn vị phân loại, bao
gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, ElaphoCordyceps, MetaCordyceps và
OphioCordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae.

nhận nhƣ C.tuberculata, C.subsessilis, C.minuta, C.myrmecophila, C.Canadensis,
C.agriota, C.gracilis, C.ishikariensis, C.konnoana, C.nigrella, C.nutuc, C.pruinosa,
C.scarabaeicola, C.sphecocephala, C.tricentri… Loài nấm Cordyceps sinensis xuất
hiện nhiều bên ngoài tự nhiên hơn cả, thƣờng phân bố ở độ cao trên 2000m so với
mực nƣớc biển, tập trung chủ yếu ở Tây Tạng – Trung Quốc. Tuy nhiên hiện
nay các nhà khoa học đang gặp khó khăn trong việc tìm ra môi trƣờng phù
hợp để nuôi cấy loài nấm này. Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu
đã tiến hành nuôi trồng nấm C. miltaris trên môi trƣờng nhân tạo, loài nấm
này có các hoạt chất hóa học tƣơng tự và dễ dàng nuôi trồng trên môi trƣờng
nhân tạo so với loài C.sinensis [24].
2.1.2. Nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Clavicipitaceae, giống
Cordyceps. Loài này đƣợc Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi
Clavaria militaris. Ở Trung Quốc, C. miltaris đƣợc đặt tên là “Dong Chong


6
Xia Cao” hoặc “Chong Cao” đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc y học cổ
truyền và thực phẩm chức năng trong các loại thảo mộc của Trung Quốc [2].

Hình 2.1: Nấm Cordyceps militaris [30]
Bảng 2.1: Bậc phân loại nấm
Giới
Ngành

Fungi
Ascomycota

Lớp


Bộ

Họ

Loài

Coleoptera

Scarabaeidae

Lachnosterna quercina

Diptera

Tipulidae

Tipula paludosa

Hymenoptera

Cimbicidae

Cimbex similis

Lepidoptera

Bombycidae

Andraca bipunctata


+ Protein chiếm 40.69 %.
+ Các loại vitamin: vitamin A (34.7 mg/g), vitamin B1 (13.0 mg/g),
vitamin B6 (62.2 mg/g), vitamin B12 (70.3 mg/g), vitamin B3 (42.9 mg/g).
+ Các nguyên tố khoáng: Se (0.44 ppm), Zn (130.0 ppm), Cu (29.15 ppm).


9
+ Hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1.52 %),
cordycepic axit (11.8 %), polysaccharide (30 %).
Bảng 2.3: Các hoạt chất trong Cordyceps
Hoạt chất sinh học

Tác dụng
 Kháng khuẩn
 Kháng viêm

Cordycepin

 Ức chế kết tập tiểu cầu
 Kháng u
 Giảm mỡ máu
 Điều trị suy tim mãn tính
 Tăng miễn dịch

Adenosine

 Điều tiết máu
 Hỗ trợ chống bệnh trầm cảm
 Chống co giật, mất trí nhớ và giảm đau
 Kháng virus

cordycepin có tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết. Điểm nóng chảy
2280C - 231 0C, với bƣớc sóng hấp thụ cực đại là 259 nm. Cordycepin có thể
hòa tan trong nƣớc muối, rƣợu ấm, methanol [29]. Cấu trúc của cordycepin
bao gồm một phân tử nucleoside purine (adenine) gắn với một ribose đƣờng
(ribofuranose) qua một liên kết β-N9-glycosidic. Sự tổng hợp hóa học của
cordycepin đạt đƣợc chủ yếu thông qua việc thay thế nhóm OH ở vị trí 3'
trong nhóm ribofuranosyl với H, tạo ra một chất tƣơng tự deoxy của
adenosine.
Cordycepin có tác dụng:
+ Tác dụng chống viêm nhiễm: Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan
đến quá trình ung thƣ. Các tế bào ung thƣ sinh nhiều cytokine, chemokine và
các receptor của của tế bào ung thƣ, các chất này gây ra phản ứng viêm.
Cordycepin đƣợc cho rằng làm giảm các tác nhân gây ra viêm nhƣ NO,
PGE2, TNF α và IL 1β.
+ Tác dụng làm giảm đƣờng huyết: hoạt chất cordycepin không làm gia
tăng nồng độ insulin trong máu, nhƣng vẫn làm giảm hàm lƣợng glucose máu
thông qua tác dụng làm tăng nồng độ glycogen trong gan. Đồng thời
cordycepin có tác dụng bảo vệ thận và giảm chấn thƣơng lách do tiểu đƣờng
gây ra.
+ Ức chế sinh tổng hợp purine, tổng hợp DNA/RNA: Sau khi vào trong tế
bào, cordycepin đƣợc chuyển thành 5' mono-, di- và tri-phosphate ức chế hoạt
động của các enzyme, chẳng hạn nhƣ ribose-phosphate pyrophosphokinase và
5-phosphoribosyl-1 pyrophosphate amidotransferase, đƣợc sử dụng trong quá
trình tổng hợp của purine. Bởi vì sự giống nhau của nó với adenosine,


11
cordycepin có thể tham gia vào các quá trình phân tử khác nhau trong tế bào,
chẳng hạn nhƣ tổng hợp DNA hoặc RNA. Hơn nữa, nghiên cứu cho thấy rằng
cordycepin có thể đóng con đƣờng tín hiệu mTOR bằng cách kích hoạt AMP


ATR

và

histone

γH2AX

[13],[23],[24].

Cordycepin (3′-deoxyadenosine)
Adenosine
Hình 2.3: Công thức hóa học của cordycepin và adenosine
Adenosine
Công thức phân tử là: C10H13N5O4. Trọng lƣợng phân tử: 267.24 g/mol.
Adenosine dạng bột tinh thể có màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235 0C.
Adenosine có tác dụng:
+ Tác dụng chống viêm: Adenosine đƣợc chứng minh là một chất có khả
năng kháng viêm tại thụ thể của adenosine A2A. Nồng độ adenosine ngoại
bào ở tế bào bình thƣờng là khoảng 300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn
thƣơng nồng độ này nhanh chóng nâng lên từ 600 đến 1200 nM.
+ Tác dụng trên tim: Hoạt chất Adenosine trực tiếp kiểm soát các chức
năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ
tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất. Hoạt chất Adenosine đƣợc
dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim [8].
+ Tác dụng trên phổi và thần kinh trung ƣơng: Adenosine có khả năng điều
chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến bệnh viêm đƣờng hô hấp nhƣ bạch
cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosine có tác dụng tốt đối với một số bệnh rối
loạn thần kinh nhƣ thiếu máu cục bộ, thoái hóa thần kinh… [8].

Sterols
Một số hợp chất hóa học dạng sterol đã đƣợc tìm thấy trong nấm ĐTHT đó là
ergosterol, Delta-3 ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol,
và campasterol.


14
Ergosterol
Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D. Hàm lƣợng ergosterol ở
Cordyceps militaris nuôi cấy rất cao, chỉ đứng sau Cordyceps sinensis tự
nhiên phân lập ở Tây Tạng. Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có
hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm
immunoglobin A [29].
Tổng hợp một số công dụng chính của nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là loài nấm có giá trị dƣợc liệu có tác dụng: Chống
viêm, chống oxy hóa, chống lão hóa, ngăn chặn di căn, điều hòa tăng cƣờng
miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, hạ đƣờng huyết, bảo vệ
thần kinh, hỗ trợ bảo vệ gan, hỗ trợ các bệnh về tim.
Cordyceps militaris tăng cƣờng năng lƣợng tế bào ở dạng ATP
(adenosine tri-phosphate). Trong quá trình thuỷ phân phosphate từ ATP, rất
nhiều năng lƣợng đƣợc giải phóng và đƣợc sử dụng bởi tế bào. Các nghiên cứu
trƣớc đây về Cordyceps đã chứng minh rằng nó có chống vi khuẩn, chống nấm,
diệt cỏ, chống viêm, chống bệnh tiểu đƣờng, chống oxy hóa, chống khối u,
apoptotic, miễn dịch, miễn dịch chống virus HIV và nhiều tác dụng khác [24].
Cordyceps militaris từ lâu đã đƣợc sử dụng trong sản xuất thuốc phổi,
thận, điều trị viêm phế quản mạn tính, hen, lao và các bệnh khác của hệ hô
hấp. Cordyceps làm giảm huyết áp cao thông qua các phản ứng trực tiếp hoặc
trung gian với các thụ thể M-cholinergic dẫn đến cải thiện tuần hoàn máu và
mạch máu. Do đó, Cordyceps có thể điều trị hoặc khắc phục tình trạng co thắt
nhịp tim. Chiết xuất Cordyceps giúp điều trị suy tim mãn tính, ngăn ngừa nhồi

sáng, thiết bị phun ẩm để cung cấp ẩm,
sử dụng điều hòa để ổn định nhiệt độ
nuôi cấy.
- Cần nhân công vận chuyển bình
giống từ phòng nuôi tối sang phòng

Bình giống đƣợc nuôi hoàn toàn trong
tối:
- Sử dụng điều hòa ổn định nhiệt độ
nuôi. Không cần đèn chiếu sáng, không
cần cung cấp độ ẩm [12].
- Không tốn công vận chuyển.

sáng.
Hàm lƣợng cordycepin thấp [22]

Hàm lƣợng cordycepin cao [12]

2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi
trƣờng lỏng trong và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Ngày nay, khi lƣợng ĐTHT ngoài thiên nhiên rất khan hiếm và bị ngăn
cấm thu hoạch thì việc trồng nhân tạo để thu sinh khối đƣợc thực hiện nhƣ là


16
một giải pháp thay thế. Tuy nhiên, các chủng nấm ĐTHT phân lập từ các nơi
khác nhau sẽ phát triển trên các môi trƣờng có thành phần tỉ lệ dƣỡng chất
cũng nhƣ sản sinh các hoạt chất khác nhau. Ví dụ nhƣ thể quả của nấm ĐTHT
có hình dạng, kích thƣớc và màu sắc khá khác nhau khi đƣợc nuôi bởi các

Năm 2007, I.-L. Shih, K.-L. Tsai và C. Hsieh đã tiến hành nghiên cứu:
“Ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của nấm và sản sinh
chất chuyển hóa sinh học trong môi trƣờng ngập của C. miltaris”. Kết quả
nghiên cứu cho thấy giá trị pH ban đầu, các nguồn nitơ khác nhau, dầu thực
vật đều ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất expolysaccharides (EPS), adenosine
và đặc biệt là cordycepin. Các điều kiện tối ƣu cho sự phát triển của sợi nấm
sản xuất EPS và cordycepin đƣợc quan sát ở pH tƣơng đối thấp. Trong số các
nguồn hữu cơ, chiết xuất nấm men (YE) thuận lợi cho sản xuất EPS và
cordycepin, trong khi đó bột ngô là thuận lợi cho sản xuất adenosin. Tỷ lệ
C/N thấp hơn thuận lợi cho sản xuất adenosine và cordycepin; tuy nhiên tỷ lệ
C/N quá thấp sẽ làm giảm sản lƣợng. Tất cả các loại dầu thực vật thử nghiệm:
dầu đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu oliu đều kích thích sự phát triển của sợi
nấm và sản xuất EPS của C. miltaris, nhƣng chúng không có ảnh hƣởng nhiều
đến sản xuất adenosine và cordycepin. Điều kiện tối ƣu để sản xuất
cordycepin bởi C. miltaris ở pH 6, nồng độ YE 45 g/l [11].
Năm 2010, tại Trung Quốc các nhà khoa học T.C Wen, J.C.Kang,
B.X.Lei, G.R.Li và J.He đã tiến hành nghiên cứu: “Tăng cƣờng sản xuất
cordycepin bằng cách sử dụng chất phụ gia trong nuôi cấy C. miltaris”. Tiến
hành nuôi cấy trên môi trƣờng có thành phần: glucose 26.25 g/l, peptone
26.25 g/l, adenine 7.50 g/l, histidine 4.50 g/l, MgSO4⋅ 7H2O 0.1 g/l, và
KH2PO4 0.1 g/l. Trong điều kiện này, sản lƣợng cordycepin tối đa trong môi
trƣờng nuôi lỏng là 18.92 mg/g trong 39 ngày [21].