BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ
SẢN PHẨM SỮA BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH
MÃ SINH VIÊN: 1301033

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ
SẢN PHẨM SỮA
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Cao Sơn
2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiên:



MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... - 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. - 2 1.1. Tổng quan về Immunoglobulin G .................................................................. - 2 1.1.1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G........................... - 2 1.1.2. Cấu trúc của immunoglobulin G ................................................................. - 3 1.1.4. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa ..................................... - 4 1.2. Các phương pháp định lượng IgG .................................................................. - 5 1.2.1. Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch ........................................ - 5 1.2.2. Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách ......................................... - 7 1.3. Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. ........................ - 9 1.3.1. Khái niệm .................................................................................................... - 9 1.3.2. Nguyên tắc................................................................................................... - 9 1.3.3. Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................ - 10 1.3.4. Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao . ................. - 13 1.3.5. Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G .............................. - 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ................. - 15 2.1. Đối tượng...................................................................................................... - 15 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................... - 15 2.2.1. Thiết bị ...................................................................................................... - 15 2.2.2. Dụng cụ ..................................................................................................... - 15 2.2.3. Hóa chất, chất chuẩn ................................................................................. - 15 2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... - 16 2.3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa ........ - 16 2.3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng ......................... - 16 2.3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị
trường Việt Nam.................................................................................................. - 16 ii


2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. - 16 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn ................................................................................. - 17 2.4.2. Pha các dung dịch đệm .............................................................................. - 17 2.4.3. Quy trình xử lý mẫu .................................................................................. - 18 2.4.4. Phương pháp phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao .................. - 18 2.4.5. Thẩm định phương pháp [2]...................................................................... - 19 2.4.6. Phương pháp xử lý kết quả........................................................................ - 20 2.4.7. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ - 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... - 21 3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và các sản phẩm sữa ..... - 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng thiết bị HPLC. ....................... - 21 3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu. ................................................................... - 25 3.2. Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng ............................ - 28 3.2.1. Độ đặc hiệu................................................................................................ - 28 3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)........................ - 29 3.2.3. Khoảng tuyến tính. .................................................................................... - 31 3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ............................................................................. - 32 3.2.5. Độ lặp lại khác ngày .................................................................................. - 33 3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường
Việt Nam ............................................................................................................. - 34 3.4. Bàn luận ........................................................................................................ - 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. - 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... - 39 PHỤ LỤC ............................................................................................................ - 42 -

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
AOAC

Giải nghĩa
Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các cộng
đồng phân tích chính thức)

IgG

Immunoglobulin G

Igs

Affinity chromatography (Sắc ký ái lực)
Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

SDS-PAGE
(Điện di polyacrylamide với SDS)
LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of Qualification (Giới hạn định lượng)

DAD

Diode-array detectors ( Detector mảng diod)

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG .............................................. - 2 Bảng 1.2. Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG .......................................... - 4 Bảng 1.3. Khả năng liên kết của protein với kháng thể. ..................................... - 12 Bảng 1.4: Một số nghiên cứu về định lượng IgG ............................................... - 13 Bảng 2.1. Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g) ................................... - 17 Bảng 3.1. Khảo sát khối lượng cân mẫu ............................................................. - 27 Bảng 3.2: Tỉ lệ S/N ở nồng độ LOD 0,01 mg/g .................................................. - 30 Bảng 3.3. Độ chệch của các nồng độ chuẩn........................................................ - 31 Bảng 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi....................................................................... - 33 Bảng 3.5. Độ lặp lại khác ngày ........................................................................... - 34 Bảng 3.6. Kết quả định lượng mẫu thực ............................................................. - 35 -

v


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu tạo của IgG .................................................................................... - 3 Hình 1.2. Phương pháp plasmon bề mặt ............................................................... - 7 Hình 1.3. Quá trình trong sắc ký ái lực .............................................................. - 10 Hình 1.4. Protein G được gắn trên Sepharose. .................................................... - 11 Hình 3.1. Khảo sát pH dung dịch nạp ................................................................. - 22 Hình 3.2. Thể tích nạp ......................................................................................... - 23 Hình 3.3. Khảo sát pH rửa .................................................................................. - 24 Hình 3.4. Sắc ký đồ rửa lại khi khảo sát pH =3 .................................................. - 24 Hình 3.5. Khảo sát thể tích rửa............................................................................ - 25 Hình 3.6. Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu ......................................................... - 28 Hình 3.7. Phổ hấp thụ IgG trong nghiên cứu ...................................................... - 29 Hình 3.8. Phổ hấp thụ IgG ................................................................................. - 29 Hình 3.9. Phổ hấp thụ ở nồng độ 0,5mg/g .......................................................... - 29 Hình 3.10. Phổ hấp thụ ở nồng độ 1mg/g ........................................................... - 29 Hình 3.11. Sắc ký đồ của nồng độ LOD 0,01 mg/g ............................................ - 30 Hình 3.12. Đồ thị khảo sát sự tuyến tính............................................................. - 32 -

vi

1.1.1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G
Immunoglobulin G (IgG) là một trong số những kháng thể của cơ thể người và động vật.
IgG chiếm khoảng 80% tổng lượng kháng thể. IgG chủ yếu xuất hiện trong huyết thanh,
chiếm 75% của tất cả các Igs trong huyết thanh. IgG có chủ yếu trong các khoang ngoài
mạch máu, là lớp duy nhất của Igs có khả năng đi qua nhau thai, do đó việc miễn dịch được
đảm bảo truyền từ mẹ sang con.
Chức năng quan trọng nhất của IgG là giúp cơ thể miễn dịch, thông qua quá trình hoạt
hóa bổ thể. Chức năng khác của IgG là khả năng gắn các tế bào như các đại thực bào, các
bạch cầu đơn nhân, các bạch cầu đa nhân trung tính một số tế bào lympho có các thụ thể Fc
cho vùng Fc của IgG, giúp tế bào có thể tiếp nhận các kháng nguyên tốt hơn. Chức năng
của các phân lớp dưới của IgG được thể hiện ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG

Các
Khả
phân Tỷ
Khả năng
năng qua
TT lớp lệ
hoạt hóa
nhau
dưới %
bổ thể
thai
IgG

Khả năng gắn
thụ thể Fc trên
các tế bào thực
bào

21 ngày

3

IgG3

7

Có

Cao nhất

Ái lực cao

7 ngày

4

IgG4

4

Có

Không

Ái lực trung bình

21 ngày


liên kết disulfid và chiều dài của vùng bản lề. [24]

1.1.4. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa
IgG có thể được đưa vào cơ thể qua tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, hoặc bổ sung qua đường
ăn uống bằng việc sử dụng các loại thực phẩm chức năng, sữa non và sữa công thức. Trong
sữa và sữa non của bò, immunoglobulin G (IgG; phân lớp dưới IgG1 và IgG2) là thành
phần miễn dịch chính, mặc dù mức IgA thấp và IgM cũng có mặt [7, 8].
Bảng 1.2. Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG
Loài

Bò

Người

Kháng thể

Nồng độ (mg/ml)
Huyết thanh

Sữa non

Sữa

IgG

25,0

32–212

0,72


0,04

IgG

12,1

0,4

0,04

IgA

2,5

17,4

1,00

IgM

0,9

1,6

0,10

Ở động vật nhai lại như bò, IgG1 cấu thành khoảng 80% tổng hàm lượng Igs trong sữa,
trong khi Igs chủ yếu trong sữa ở hầu hết các loài có vú không nhai lại khác (bao gồm cả
con người) là IgA. IgA và IgM cũng được tổng hợp bởi các tế bào biểu mô hoặc tế bào biểu

1.2.1.2. Phản ứng miễn dịch Elisa
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa
trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với
một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản
-5-


ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã
xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà
biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và
đơn giản. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm,
kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và
chất tạo màu, thực hiện qua hai bước:
-

Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

-

Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy

nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp
trong dung dịch thí nghiệm. Phương pháp định lượng IgG bằng phương pháp Elisa có thể
định lượng 1ng/ml [14]. Tuy nhiên khoảng tuyến tính của phương pháp này khá nhỏ khi
phân tích mẫu thực cần pha loãng rất nhiều lần, dẫn đến việc tốn thời gian, hoá chất và sai
số do pha loãng. Mặc dù các bộ kit định lượng trên thị trường đã thương mại hóa nhưng giá
thành vẫn còn rất cao, tốn kém chi phí vì chỉ được dùng được một lần.


1.2.2.1. Điện di gel
Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách và đôi khi tinh chế các chất đặc biệt là các protein
và các acid nucleotide trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và hình dạng của chúng.

-7-


Các phân tử protein và acid nucleic có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như
giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamid gel. Trong đó gel của
agarose và polyacrylamid được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn
đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp
các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi
trong một khoảng tương đối. Khả năng di chuyển của các phân tử protein và acid nucleic
trong điện trường là khác nhau tùy thuộc vào độ ion, cường độ điện trường, kích thước và
hình dạng. Sau khi tách hoàn thành, các dải protein có thể được phát hiện bằng cách xử lý
gel với một chất phát hiện vết Coomassie Blue, liên kết đặc biệt với protein, mỗi dải đại
diện cho một protein. Định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị đo độ hấp thụ
và nội suy từ đường chuẩn được xây dựng trên các protein chuẩn [18]. Nền gel sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) thường được sử dụng
trong định lượng IgG. Khi đó IgG được cắt thành các chuỗi nhẹ và nặng, xuất hiện dưới
dạng các dải riêng biệt. Do đó SDS-PAGE không thể phân biệt IgG ở giai đoạn ban đầu là
trạng thái tự nhiên hay bị biến tính. Khoảng định lượng của phương pháp này 0,2 mg/ml –
3,5 mg/ml. [19]. Kỹ thuật này không hay được dùng để định lượng IgG.

1.2.2.2. Sắc ký rây phân tử (SEC)
Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích
thước của chúng. Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu cơ, kỹ thuật được gọi
là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc
trên gel. Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp, và được pha động
dẫn chạy qua cột.

kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ
di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực
tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rủa giải các chất ra khỏi cột vì
vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Sắc ký ái lực là một kiểu sắc ký của HPLC. [1]

1.3.2. Nguyên tắc
Các hợp chất sinh học, như enzyme và cơ chất hoặc kháng nguyên và kháng thể, sở hữu
những đặc trưng nhận biết giữa chúng một cách chọn lọc để tạo thành các hợp chất phức.
Sắc ký ái lực là một phương pháp phân tách và tinh chế các chất vận dụng tính ái lực sinh
học của chúng. Tương tác giữa chúng thường có thể đảo ngược. Một phân tử được cố định

-9-


(pha tĩnh) có ái lực với chất phân tích, sau đó chất phân tích được rửa giải nhờ gradient pha
động [20].
Quy trình trong sắc ký ái lực gồm 4 bước sau:
(1) Cân bằng cột
Nhồi cột bằng pha tĩnh gồm phần chất mang đã cố định sẵn một phối tử phù hợp với mục
tiêu phân tách trên bề mặt. Cột được cần bằng nhờ dung môi chạy mẫu.
(2) Thêm mẫu và hấp phụ với hợp chất mục tiêu (Hình a)
Mẫu được đưa vào cột và thành phần mục tiêu hấp phụ lên trên pha tĩnh.
(3) Rửa cột (Hình b)
Việc rửa cột nhằm loại bỏ những thành phần không hấp phụ lên pha tĩnh.
(4) Xả cột (Hình c)
Dung môi được đưa vào để rửa giải thành phần mục tiêu đang hấp phụ trên pha tĩnh ra
khỏi cột nhằm thu hồi chúng. Quy trình bắt đầu lại từ bước (1). [27]

Hình 1.3. Quá trình trong sắc ký ái lực [27]


do đó tránh các phản ứng không mong muốn với albumin. Protein tái tổ hợp G chứa hai
vùng rằng buộc Fc. Protein G Sepharose là một sự lựa chọn tốt hơn cho việc thu thập các
kháng thể chung vì nó gắn kết một phạm vi rộng hơn của IgG từ các loài sinh vật và liên
- 11 -


kết nhiều lớp IgG. Thông thường protein G có liên kết mạnh hơn protein A và thể hiện gắn
ít nhất với albumin, kết quả là chế phẩm sạch hơn và năng suất cao hơn. Sức kết dính protein
G với IgG phụ thuộc vào các nguồn và phân lớp của globulin miễn dịch. Khả năng liên kết
năng động phụ thuộc vào độ bền liên kết và trên một số các yếu tố khác, chẳng hạn như tốc
độ dòng chảy trong quá trình áp dụng mẫu. Nhiều kháng thể cũng tương tác ái lực thấp với
protein G thông qua vị trí Fab. Protein G hầu như không có liên kết với IgM, IgA hoặc IgE
ở người, mặc dù một số chúng liên kết yếu với protein A. Các phối tử protein G trong quá
trình sử dụng luôn luôn có khả năng bị tách ra khỏi chất nền, đặc biệt trong điều kiện rửa
giải khắc nghiệt. Sự gắn bó nhiều điểm của protein G với Sepharose cho kết quả mức rò rỉ
rất thấp trong một loạt các điều kiện rửa.
Bảng 1.3. Khả năng liên kết của protein với kháng thể. [27]
Phân lớp kháng thể

Liên kết với protein A

Liên kết với protein G

IgA

Không xác định

–

IgD


Kháng thể

++

++++

Chó

Kháng thể

++

+

IgG1

+

++++

IgG2a

++++

++++

IgG2b

+++


Nền mẫu

Phương pháp định
lượng

Nồng độ IgG
trong sữa
%(kl/kl)
0.03–1.3

Sữa lạc đà

RID

Sữa non của bò

Elisa

Sữa và sữa non của bò

SPR

Sữa bò

SDS-PAGE

Sữa non lạc đà

SEC


- 13 -


rộng rãi như Elisa hay tới những phương pháp đang được triển khai nghiên cứu như SPR,
SEC..., nhưng vẫn còn những bất cập mắc phải
Từ những ưu điểm đã được chỉ ra trong tổng quan về sắc ký ái lực và cột Protein G,
nên nghiên cứu đã lựa chọn làm phương pháp định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa.

- 14 -


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu của phương pháp này là IgG có trong sữa và sản phẩm sữa, cụ thể
chính là IgG của bò.
Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và ứng dụng
phương pháp bao gồm sữa và các thành phẩm từ sữa.

2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1. Thiết bị
-

Hệ thống sắc ký HPLC Aliance 2965 của hãng Waters.

-

Máy ly tâm Mikro, Hittech.

-


Chuẩn IgG (Sigma Cat. No. I5506, Sigma – Aldrich) (độ tính khiết 95%).

-

Na2HPO4 (Merck). (hàm lượng ≥ 99%)

-

NaCl (Merck). (hàm lượng ≥ 99,5%)

-

Glycine (Merck). (hàm lượng ≥ 99,7%)

-

NaOH (Merck). (hàm lượng ≥ 97,0%)

-

HCl (Merck). (hàm lượng 37 - 38%)

- 15 -


2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa
2.3.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng máy HPLC
Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng:


Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ.

-

Khoảng làm việc.

-

Độ chụm (độ lặp lại).

-

Độ đúng (độ thu hồi).

-

Độ lặp lại khác ngày.

2.3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị
trường Việt Nam
Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá hàm lượng IgG trong các sản phẩm sữa
khác nhau.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

- 16 -


2.4.1. Pha dung dịch chuẩn

3,988

0,05

0,020

3,980

0,1

0,040

3,960

0,5

0,200

3,800

1

0,400

3,600

3

1,200