Xác định hàm lượng allantoin
trong củ mài {Dioscorea persÊmìlis
Dioscoreaceae) bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao
Trần Thị Oanh\ Nguyễn Thị Vân Anh^
Kục Khoa học công nghệ &Đào tạo - Bộ Y tế, Kònq ty cổphân Traphoco

SUMMARY
A simple and reliable HPLC with u v detection was reported for the determination of allantoin in (Dioscorea persimilis
Dioscoreơceae). The chrom atographic separation was achieved by using a cyano column (150 X 4.6mm, Sjjm ) at 25°c Effluent was
monitored Ơt215nm using a mixture ofmethanol-water (2:98) ƠS the mobile phase at Ũ flow rate of 0.2 ml/min. The total run time was
less than 15 min. The content ofollontoin in 15 real samples ranged from 1.21 to 6.18 mg/g dry weight
Từkhoá:Allantoin, Củ mài, HPLC, cộtcyano.

Đ ặt vấn đề

Củ mài còn gọi là Hoài sơn có tên khoa học là
Dioscorea persimilis (Dioscoreaceae), được dùng rộng
rãi làm thức ăn cũng như thuốc chữa bệnh. Chuyên
luận "Củ mài" trong Dược điển Việt Nam IV quy định
bộ phận dùng là rễ củ với tiêu chuẩn chất lượng yêu
cầu các chỉ tiêu kiểm nghiệm là mô tả, bột, định tính
(dựa vào soi huỳnh quang bột dược liệu, sắc ký lớp
mỏng với chuẩn là dược liệu Củ mài chuẩn), tạp chất,
độ ẩm [ 1 ], Đã có một số nghiên cứu chỉ ra rằng, dược
liệu trong chi Dioscorea có chứa một lượng lớn chất
có hoạt tính sinh học là allantoin - một dẫn chất purin
[6], Allantoin có khả năng làm lành vết thương, bảo vệ,
làm mềm da và chống viêm, chống gây độc tế bào,...
[7]. Có nhiểu nghiên cứu định lượng allantoin trong
dịch sinh học được công bố như HPLC dẫn chất hóa

Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mểm
Aligent Chemstation version B.
Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01
mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc
xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius
sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo Nhật; Nổi cách thủy
WiseCircu',Tây Ban Nha.
Các dụng cụ thủy tinh chính xác.
Phương pháp nghiên cứu
Điểu kiện sâc ký:
Cột: Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, 5 um), nhiệt độ
Cột25°c.
Pha động: Methanol - nước (2:98).


Kết quả cho thấy cột Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, 5
ịjm) cho pic allantoin cân đối, tách khỏi đường nền rõ
ràng, thời gian phân tích ngắn nên cột này được lựa
chọn dùng trong nghiên cứu.
Thực hiện sắc ký allantoin VỚI các hệ pha động
gồm: 1) dung dịch đệm phosphat 20 mM, pH 3,0; 2)
methanol - nước với tỷ lệ thay đổi, của methanol 0 10% (AC = 2%), nước từ 100 - 90%, lưu lượng dòng 1
ml/ phút hoặc chế độ gradient lưu lượng dòng. Kết
quả cho thấy, khi sử dụng pha động là dung dịch
đệm phosphat 20 mM, pH 3,0 pic của allatoin không
ổn định; còn với hệ pha động 2, khi tăng tỷ lệ dung
môi hữu cơ thì thời gian rửa giải của allantoin giảm,
nhưng vẫn chưa đạt độ phân giải đường nền, nếu tỷ
lệ nước 100% thời gian phân tích quá dài. Do đó, việc
kết hợp giữa hệ pha động chứa tỷ lệ lớn là nước (98%)

Nghiên cứu này được tiến hành theo phương
từ 12,5 -100 |ag/ml, với hệ số tương quan r > 0,999.
pháp được Kee Dong Yoon et al. (2008) xây dựng, với
một vài thay đổi nhỏ. Do đó, chúng tôi không tiến
Kết quả nghiên cứu
hành thẩm định toàn bộ các tiêu chí yêu cầu đối với
Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích
xây dựng một quy trình mới, mà chỉ thực hiện thẩm
định một số tiêu chí nhằm đánh giá giá trị sửdụng của
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sác ký
Dựa vào các kết quả nghiên cứu định lượng phương pháp, bao gồm tính chọn lọQ khoảng nồng
allantoin bằng HPLC đã công bố [5, 6, 8], tiến hành độ tuyến tính (sử dụng để tính kết quả định lượng
khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp và trong mẫu thực), độ chính xác
Tính chọn lọc
khả thi.
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng (cô cách
- Tiến hành khảo sát trên cột sắc ký nhồi pha tĩnh
octadecyl (C18), cyano (-CN) của các hãng khác nhau, thủy tới cắn 5 ml ethanol 95%, hòa cắn trong vừa đủ 5
bao gồm Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm, 5 ịiiTi), Hypersil ml nước, lọc qua màng lọc 0,22 |am), dung dịch chuẩn
C18 BDS (250 X 4,6 mm, 5 laỉTì), Zorbax Eclip C18 (150 X allantoin, dung dịch thử từ 1 mẫu dược liệu Củ mài
3,9 mm, 3,5 |im) và Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, 5 |jm). (CM1 ). Kết quả được trình bày ở hình 1 .
Detector: u v 215 nm.
Thể tích tiêm mẫu:5 |il.
Tốc độ dòng: 0,2 ml/ phút
Chuẩn bị các dung dịch:
Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một lượng
chất chuẩn tương đương khoảng 25 mg allantoin cho
vào bình định mức 50 ml, hòa tan trong vừa đủ thể
tích bằng nước
Dung dịch chuẩn làm việc Pha loãng chính xác

10
5
8

(a)

10

12

14 m in

(b)

mAU
25

20
15

9 .5 9 5

Allantoin

10

5

0
10

Diện tích pic (mAU. giây)

63,8

124,3

263,1

391,1

517,7

Phương trình hổi quy; y = 5,222 X -2,1524
Hệ số tương quan: r = 0,9998

Độ chính xác của phương pháp được đánh giá dựa vào sự phân tán số liệu (RSD) khi tiến hành phân tích 6
lẩn riêng biệt trong 1 ngày trên một mẫu bột dược liệu Củ mài (CM l) theo quy trình trên. Kết quả cho thấy hàm
lượng allantoin trong mẫu thử có giá trị trung bình là 3,91 mg/g tính theo dược liệu khô với RSD = 2,93% (n = 6).
ứng dụng

Tiến hành định lượng allantoin trong các mẫu nghiên cứu gồm 6 mẫu Củ mài thu hái tự nhiên, 4 mẫu Củ mài
trổng. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích
với hệ số tương quan không nhỏ hơn 0,999. Kết quả được trình bày ở hình 2 và bảng 3.


mẵSS

25f
2ữ
15


■lUĩ

mm

25

25

9 .5 B 9

20
IS

20

ÌAIcmtoln

9.59S
AtoiToín

15

10

lỉl

5

5

CM6

CMS
mãXỊ
25

2Ũ
15

9.S91
ịMgx^oin

10
5

0
0

2

4

6

i

10

12


CM10

lỡ

12

14 wăM


Bảng3. KếtquảhàmlượngQllantoinữongcácmẫuCủmài (n=3)
Củ mài thu hái tự nhiên
TT

Tên mẫu

Độ ẩm (%)

P(mg/g)

1

CM1

6,10

3,91

2

CM2


CM6

9,35

5,78

7

CM7

7,08

3,21

8

CM8

6,79

4,26

9

CM9

7,25

4,78


5,36

14

CM14

7,00

3,22

15

CM15

7,21

5,48

Củ mài trổng

P: Hàmlượngallantoin(mg/g) tínhtheodượcliệukhô

Bàn luận

Xu hướng hiện nay là ứng dụng các phương pháp
phân tích hiện đại (quang phổ, HPLC, G C ,...) để tiêu
chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu với
các chất đánh dấu có hoạt tính sinh học nhằm đánh
giá đúng và góp phẩn kiểm soát chất lượng dược liệu.

Chuyên luận "Củ mài" ở Dược điển Việt Nam IV [1 ]
chưa để cập tới chỉ tiêu định lượng, allantoin là một
hoạt chất có hoạt tính sinh học với hàm lượng tương
đối lớn trong dược liệu thuộc chi Dioscorea [6]. Do
đó, kết quả của nghiên cứu góp phán cung cấp quy
trình phân tích mới định lượng hoạt chất trong Củ mài
nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của
dược liệu này.
Hàm lượng allantoin trong Củ mài từ các nguồn
khác nhau như thu hái trong tự nhiên tại các tỉnh
khác nhau và trồng tại một địa điểm có sự dao động
trong khoảng từ 1,21 - 6,18 mg/g. Trong đó, mức độ
dao động hàm lượng allantoin trong các mẫu Củ mài
trổng và thu hái tự nhiên của các mẫu nghiên cứu
tương đương nhau; tuy nhiên hàm lượng hoạt chất
của mẫu trổng thấp hơn so với nguồn thu hái trong tự

nhiêa kết quả cụ thể biểu thị hàm lượng trung bình
± RSD của các mẫu dược liệu có nguồn gốc tự nhiên
và trồng lán lượt là 5,21 mg/g ± 17,5% với n = 6; 3,65
mg/g ± 41,9% với n = 9. Kết quả này cho thấy có thể
tiêu chuẩn hóa dược liệu Củ mài dựa vào hàm lượng
allantoin nhằm kiểm soát chất lượng nguyên liệu đẩu
vào của quá trình sản xuất đảm bảo ổn định chất
lượng sản phẩm.
Kết luận

Phương pháp HPLC định lượng allantoin trong
Củ mài có tính chọn lọc cao, độ chính xác đảm bảo,
khoảng tuyến tính rộng phù hợp với điểu kiện thiết bị

5.

Ghasem Haghi *, Rohollah Arshi and Alireza Safaei (2008), Improved High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for
Qualitative and Quantitative Analysis of Allantoin in Zea maysJ.Agric. FoodChem., 56 (4), pp. 1205-1209.

6.

Kee Dong Yoon, Min-Hye Yang, Young-Won Chin, Ju Hyun Park, and Jinwoong Kim (2008), Determination of Allantoin in Dioscoreo
Rhizoma by High Performance Liquid Chromatography Using Cyano Columns, Natural Product Sciences, 14(4), pp. 254-259.

7.

Kiran Kumar M and Sitaram B. (2013), Biological activities, HPLC and NMR of Blepharis Glomerans, InternơtionaUournal of Biological &
Pharmaceutical Research, 4(6), pp. 437-440.

8.

Thermo Fisher Scientific Inc. (2010), Thermo Scientific Syncronis HILICHPLC Columns.

9.

Zhang, u Liu, Y., and Chen, G., (2004), Simultaneous determination of allantoin, choline and arginine inRhizoma Dioscoreae by
capillary electrophoresis.-/. Chromơtogr. A, 1043, pp. 317-312.