ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá


Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quý báu đó !
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018
Học viên

Lý Thị Huyền


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1. Protease ................................................................................................................3
1.1.1. Khái niệm ..........................................................................................................3
1.1.2. Phân loại protease .............................................................................................4
1.1.3. Cơ chế xúc tác ...................................................................................................8
1.1.4. Nguồn thu protease ...........................................................................................9
1.1.5. Ứng dụng .........................................................................................................11
1.2. Sinh tổng hợp protease .......................................................................................14
1.2.1. Chủng giống ....................................................................................................14

3.2. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp protease ......................................................33
3.2.1. Tối ưu tỉ lệ bột lõi ngô và bột đậu tương ........................................................33
3.2.2. Tối ưu tỉ lệ cám gạo bổ sung ...........................................................................34
3.2.3. Tối ưu độ ẩm ...................................................................................................35
3.2.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy .................................................................................36
3.2.5. Tối ưu pH nuôi cấy .........................................................................................37
3.2.6. Tối ưu thời gian lên men .................................................................................39
3.3. Sản xuất chế phẩm .............................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44
PHỤ LỤC .................................................................................................................48


v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu ..............................................4
Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ...........................................24
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ...................................................25
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm ...........25
Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine ....................................................................27
Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô ...................................29
Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo .............30


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH


Bột đậu tương

LN

Lõi ngô

CG

Cám gạo

TCA

Tricloacetic acid

OD

Optical density (Độ hấp thụ ánh sáng)

Hdp

Hoạt độ protease

hspl

Hệ số pha loãng

HT

Hoạt tính


nghiệp thực phẩm trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống, do hoạt tính
phân giải protein cao [16, 24]. A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại
enzyme ngoại bào như amylase, protease, pectinase, lipase, xylanase, cellulase,
catalase, phytase, glucose oxidase [23].
Sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng
kể hiệu quả sản xuất, chế phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá thành chế
phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng nhiều. Để
phát triển các dây truyền sản xuất protease đạt hiệu quả cao, có nhiều công trình
nghiên cứu đã được tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm kiếm cơ chất mới


2

thích hợp cho sinh tổng hợp protease. Bên cạnh đó thì việc tối ưu các điều kiện
môi trường (nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, thành phần môi trường) cũng được
các nhà nghiên cứu rất quan tâm, mục đích tìm ra điều kiện nuôi cấy phù hợp
nhất để thu được lượng protease nhiều và hạ giá thành sản phẩm. Để có thể chủ
động sản xuất enzyme protease bằng các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu một số điều kiện môi trường
ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus
oryzae VTCC – F - 0187”
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo quy trình sản xuất protease ngoại bào của chủng A. oryzae VTCC F - 0187 từ nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng sinh protease của chủng A. oryzae VTCC - F – 0187
sau thời gian bảo quản chủng giống.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường và điều kiện
lên men đến khả sinh tổng hợp protease của A. oryzae VTCC - F - 0187.
- Thử nghiệm lên men sản xuất chế phẩm protease thô.


(peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại
các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không dễ dàng
tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa dạng về cấu
trúc và khả năng hoạt động.
1.1.2.1. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu
Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH hoạt
động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và protease kiềm
[1].
Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu
Protease
Protease acid

Đặc điểm
Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic protease,
một số cysteine protease và metalloprotease

Protease

trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease,

tính

metalloprotease và một số serine protease

Protease kiềm

Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease

1.1.2.2. Phân loại dựa vào các tiêu chí cơ bản
Phân loại dựa trên ba tiêu chí cơ bản: loại phản ứng xúc tác, bản chất hóa học

Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.

Hình 1.3. Mô hình phân tử protease (papain) [11]
Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.


7

Hình 1.4. Mô hình phân tử protease (renin) [17]
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy
ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và proteasetiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn suất acid
của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không
có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của amino acid. Nhiều
protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về câu
tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu
cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đổi bé, nhất là các
cysteine proteinase. Các cysteine proteinase có trọng lượng phân tử vào
khoảng 20.000- 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có một số cysteine proteinase
có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium
cyoneo’fulvum (44.000), A. oryzae OUT 5038 (52.000) (Martin 1962,

do và sản phẩm [8].
Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác
sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều
thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ
chất thành hợp chất trung gian [2].
E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)


9

1.1.4. Nguồn thu protease
1.1.4.1. Protease động vật
Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc
nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến
trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả
năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông
tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực
tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm
renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra
pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất
protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia parasitica
và Mucor purillus [1].
1.1.4.2. Protease thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu
được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ
quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để
chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết
tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ

oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các
loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung
tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân
protein ở pH 2,5-3 [1].
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti...


11

cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản
xuất pho mát.
* Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên
cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số
chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae,
S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Từ S.
fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Protease từ
S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao nên còn được dùng trong công
nghiệp chế biến thịt.
Như vậy, vi sinh vật được coi là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản
xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi
sinh vật có những lợi ích chính như sau: Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi
sinh vật và giống vi sinh vật; Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16-100
giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm; Có thể điều khiển sinh tổng hợp
enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng
thu hồi); Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ
chức sản xuất. Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố
(gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp [1].

hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện
thêm về công nghệ [25].
1.1.5.3. Trong công nghiệp sữa
Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ
sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti,
B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất phomat. Trong công nghiệp sản
xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm


13

nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn [25].
1.1.5.4. Trong sản xuất bia
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của
bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân
protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự
thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính
làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da
có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc
da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn
(B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn
(S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại
nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [25].
1.1.5.5. Trong công nghiệp dệt
Protease từ vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo
(các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được
được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã
làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó

1.2.3.1. Phương pháp lên men bề mặt
Phương pháp này còn gọi là phương pháp nổi dùng nuôi cấy nấm mốc
sản xuất enzyme. Nước ta đã có truyền thống lâu đời gây mốc tương theo
phương pháp này. Trong các nhà máy rượu sản xuất từ nguồn tinh bột thì việc
gây hoá mốc đường hoá (myco - malt) cũng làm tương tự. Phương pháp nuôi
cấy bề mặt dựa trên cơ sở nuôi cấy mốc trên các lớp môi trường mỏng tiếp xúc
tốt với không khí. Môi trường dinh dưỡng chủ yếu là cám (cám mỳ tốt hơn cả)


15

loại to, có thêm ít bột, hoặc thêm những loại bã khác (bã bia, bã lõi ngô, bã khô
lạc, khô đậu tương,...) tuỳ theo mục đích sản xuất [6].
1.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy chìm (nuôi cấy bề sâu)
Vi sinh vật được dùng trong nuôi cấy theo phương pháp này là vi khuẩn
và nấm mốc. Chúng được cấy vào môi trường dinh dưỡng lỏng trong các nồi
nhân giống và lên men. Trong thời gian nuôi cấy, người ta thổi khí nén vô trùng
để cung cấp oxy cho vi sinh vật hô hấp. Phương pháp này đòi hỏi các trang thiết
bị phức tạp hơn nhiều so với phương pháp bề mặt, nhưng dễ cơ khí hoá, năng
suất cao và mặt bằng sản xuất nhỏ.
Nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp chìm trong các thiết bị kín với môi
trường lỏng vô khuẩn và khuấy đảo cùng thổi khí sạch (vô trùng tuyệt đối) liên
tục. Môi trường lỏng bao gồm các nguồn cacbon, nguồn nitơ vô cơ, hoặc nitơ
hữu cơ (bột đậu tương, khô lạc, các loại khô dầu, cao men, cao ngô,...), các chất
khoáng, các chất sinh trưởng. Trong thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi sinh
vật để thu enzyme, cần chú ý đến cơ chất cảm ứng, ví dụ: đối với amylase cần
có tinh bột, protease cần có protein. Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi vô trùng
tuyệt đối, vì vậy yêu cầu công nghệ rất cao [6].
1.2.4. Thu nhận protease
Vi sinh vật là nguồn enzyme vô cùng phong phú và giúp cho ngành công

sợi. Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sử dụng phương pháp bề mặt kinh tế hơn
[2].
1.2.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme protease
Các chế phẩm enzyme được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác
nhau. Trong một số trường hợp, môi trường nuôi cấy vi sinh trong đó có chứa
enzyme sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất, nếu các tạp
chất đó không gây tác hại đáng kê đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này
(ví dụ: sản xuất rượu, da, dùng cho chăn nuôi, nước chấm, tương,...).