ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy

Thái Nguyên, năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa ...................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa ................................................... 4
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa ................................................... 5
1.2. Các phương pháp định danh thực vật ........................................................... 6
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 7
1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 8
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14
2.1. Vật liệu thực vật.......................................................................................... 14
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị .................................................. 14
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 14
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ .................................................................................... 14


DNA

:

Deoxyribonucleic acid

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The National Center for Biotechnology Information

đồng và sai khác với mẫu SH .............................................................. 27
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK ..................... 27
Bảng 3.3. Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng
và sai khác với mẫu SH ....................................................................... 32
Bảng 3.4. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS ............... 32

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát ........................................................... 15
Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu .................................................... 19
Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá ................................................................ 20
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân ....................................................................... 21
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ ........................................................................... 22
Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa ................. 23
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR .... 24
Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK ........................................................ 25
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 26
Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. ....... 28
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ
thuật PCR............................................................................................. 29
Hình 3.11. Kết quả Blast trình tự vùng gen ITS ................................................ 30
Hình 3.12. Trình tự nucleotide của vùng gen ITS phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 31
Hình 3.13. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Bảy lá một
hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33

Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùng
làm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến. Việc xác

1


định chính xác tên loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng
sản phẩm. Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trò quan trọng trong việc bảo
tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử.
Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân
loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen
matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành
tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2
cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều. Hiện nay, số lượng các trình tự
nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài
thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực
vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng
[13], [25], [33].
Tỉnh Lai Châu là một tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam được phát hiện có
sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [20]. Mẫu cây thu được có những đặc điểm gì
và thuộc loài nào là câu hỏi được đặt ra trong nghiên cứu này. Xuất phát từ
những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái,
giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của
đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng
cây Bảy lá một hoa.


Paris polyphylla var. Alba

Quý Châu, Hồ Bắc, Vân Nam

Paris polyphylla var. chinensis

An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng
Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam , Giang
Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân
Nam, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam

Paris polyphylla var. latifolia

An Huy, Hà Nam, Hồ Bắc, Giang Tây,
Thiểm Tây, Sơn Tây

Paris polyphylla var. nana

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. panxiensis

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. polyphylla

Trung Quốc , Himalayas, phía bắc Đông
Dương


dục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm,
mặt dưới màu nhạt hơn. Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm. Lá đài
bằng số cánh tràng. Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn. Nhị mảnh, có bao phấn
màu vàng nâu, xếp thành 2 vòng, xen kẽ nhau, mỗi vòng có 5 nhị [5], [20].
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác
dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới
hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma. Ở Việt
Nam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc như
Ninh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12],
[20], [32].

5


Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một số
bệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễ
Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác
dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc. Thân rễ của cây còn chữa
sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc [12]. Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại
còn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có tác dụng: cầm ho,
giảm cơn hen. Chiết xuất hóa học trong thân và rễ còn có tác dụng cầm máu, ức
chế với mức độ khác nhau đối với trực khuẩn lị, thương hàn, tụ cầu vàng, liên
cầu khuẩn đồng thời có tác dụng ức chế Leptospira và virut cúm. Ngoài ra chiết
xuất ở cây Bảy lá một hoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung [35].
Tại vùng Quảng Tây (Trung Quốc) có câu “Ốc hữu thất diệp nhất chi hoa / Độc
xà bất tiến gia” nghĩa là trong nhà có cây Bảy lá một hoa thì rắn độc không vào
nhà được. Ngoài công dụng chữa sốt và rắn độc cắn, vị tảo hưu (thân rễ của cây
Bảy lá một hoa) còn dùng chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, ho lao, dùng ngoài da

Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhóm
tác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam
có 2 loài Ngô đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự
khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả. Những
sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngô
đồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển loài cây ngô đồng đỏ
ở Cù Lao Chàm [2].
Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích
đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt
Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban. Kết quả
nghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3].
Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêu
bản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đChâu thuộc loài Paris
fargesii [5].
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa
Sử dụng phương pháp nhuộm kép tiêu bản tế bào, chúng tôi tiến hành
làm tiêu bản với các phần thân, rễ, cuống lá. Kết quả nghiên cứu trình bày trên
hình 3.2, 3.3, 3.4.
Mạch gỗ

Biểu bì

Mô mềm

Libe

Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá

20




Biểu bì

Mô mềm ruột

Trung trụ

Vỏ trụ

Libe
Nội bì

Mạch gỗ

Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ
Hình 3.4 mô tả lát cắt ngang của rễ cây Bảy lá một hoa. Theo đó, rễ cây
Bảy lá một hoa có cấu tạo sơ cấp gồm 4 phần chính: biểu bì, ngoại bì, nội bì và
trung trụ.
Biểu bì là lớp tế bào bao bọc ngoài cùng xếp sít nhau. Các tế bào biểu bì
được gắn chặt với nhau nên dễ bị bóc tách.
Dưới lớp biểu bì có nhiều lớp tế bào dày gọi là ngoại bì. Các tế bào ngoại
bì có hình chữ U.
Nội bì (mô mềm vỏ) gồm các tế bào hình đa giác tròn đầu xếp sít nhau, ở
các góc có khoảng gian bào. Lớp này nằm sau lớp ngoại bì.
Phần trung trụ nằm ở trung tâm của rễ gồm 4 phần là vỏ trụ, mạch gỗ,
mạch libe, mô mềm ruột. Lớp vỏ trụ, nằm sát nội bì là các lớp tế bào hình chữ
nhật xếp sít nhau thành vòng bao quanh hệ mạch. Tiếp đến là libe gồm các tế
bào hình trứng cạnh nhau bắt màu hồng, xếp xen kẽ các bó gỗ với các tế bào
xếp liền nhau bắt màu xám sát vỏ trụ. Cuối cùng là mô mềm ruột nằm ở trong


SH

1000 bp
800 bp
750 bp

Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR
M: maker 1 kb; SH: sản phẩm PCR của gen matK mẫu Sìn Hồ
Kết quả khuếch đại đoạn gen matK cho thấy, trên hình ảnh điện di chỉ
xuất hiện một băng sản phẩm với kích thước khoảng 800 bp phù hợp với tính
toán lý thuyết về kích thước đoạn gen matK nhân bản bằng kỹ thuật PCR. Sau
khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu được đem đi giải trình tự trên máy giải trình
tự tự động tại Viện Công nghệ Sinh học.
Gen matK được tinh sạch và đọc trực tiếp trên máy xác định trình tự trên
máy đọc trình tự tự động và blast trên NCBI, kết quả Blast được trình bày ở
hình 3.7

24


Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK
Theo hình 3.7 đoạn gen matK của cây Bảy lá một hoa thu ở Sìn Hồ được so
sánh với 9 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 98%. Kết quả nghiên
cứu như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn matK thuộc chi
Paris. Kết quả phân tích đoạn trình tự nucleotide bằng phần mềm Bioedit thì thu
được đoạn có chiều dài 836 nucleotide, được trình bày ở hình 3.8.

25


3

HG475403 P. mairei

2014

4

GU178946 P. marmorata voucher

2011

5

KM242788 P. polyphylla var. yunnanensis

2015

6

KM242785 P. polyphylla var. chinensis

2015

7

GU178949 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher

2016


13

GU178948 P. vietnamensis voucher

2011

14

KM242792 P. vietnamensis

2011

15

SH (mẫu thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu)

P. pubescens voucher

Dựa trên trình tự nucleotide của gen matK, bằng phần mềm DNAstar
chúng tôi thiết lập bảng độ tương đồng và phân ly ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK
P. fargesii var. fargesii voucher
P. forrestii
P. mairei
P. marmorata voucher
P. polyphylla var. yunnanensis
P. polyphylla var. chinensis
P. polyphylla var. pseudothibetica voucher
P. polyphylla var. stenophylla voucher
P. polyphylla var. yunnanensis voucher


Paris polyphylla var. chinensis
Paris pubescens voucher
Paris polyphylla var. yunanensis
Paris polyphylla var. yunnanensis voucher

Paris mairei
Paris vietnamensis
Paris forrestii
Paris rugosa
Paris fargesii var. Fargesii
SH
Paris marmorata
Paris polyphylla var. pseudothibetica
Paris vietnamensis voucher
Paris polyphyla. stenophylla
Paris polyphylla

Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK.

28


3.2.3. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân vùng gen
ITS bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được ký hiệu ITS-F và ITS-R (bảng 2.4).
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 % được thể hiện ở hình
3.10. Kết quả khuếch đại vùng gen ITS cho thấy, trên hình ảnh điện di chỉ xuất
hiện một băng sản phẩm với kích thước khoảng 800 bp. Sau khi tinh sạch sản