BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------------------

Nguyễn Thị Duyên

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA
VAR. CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội, 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------------------

Nguyễn Thị Duyên

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA

Bách Khoa và Đại học Khoa học Tự nhiên - Hà Nội và các nhà khoa học Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
đã giảng dậy các môn học chuyển đổi, các chuyên đề và cho tôi đính hướng nghiên
cứu hiệu quả. Tôi xin chân thành cảm ơn các chị em công tác tại khoa Hóa thực
vật - Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ tôi và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt
quá trình làm thực nghiệm tại khoa.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Thị Hiền tại Phòng Thực nghiệm Dược
học Đại học Lund - Thụy Điển đã nhiệt tình giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu
về hoạt tính sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Xuân Phương, TS.
Nguyễn Thế Cường, ThS. Bùi Hồng Quang - Viên Sinh thái Tài nguyên - Viện Hàn
Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Ths. Nguyễn Quỳnh Nga - Khoa Tài
Nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu đã giúp tôi giám định tên khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã
hỗ trợ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận án.
Luận án này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ đề tài cơ sở Viện
Dược liệu do Ths. Nguyễn Thị Duyên làm chủ nhiệm, Quỹ L'oreal National Fellowship2016 và đề tài cấp Bộ Y tế năm 2017 do PGS. TS. Đỗ Thị Hà làm chủ nhiệm.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Duyên


MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1.3.3. Các hợp chất khác...................................................................................... 17
1.4. Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Paris.................................................. 18
1.4.1. Tác dụng chống ung thư............................................................................ 18
1.4.2. Tác dụng điều hòa miễn dịch..................................................................... 21
1.4.3. Tác dụng cầm máu và tan máu.................................................................. 21
1.4.4. Tác dụng chống oxy hóa............................................................................ 22
1.4.5. Tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng....................... 23
1.4.6. Tác dụng trên thần kinh............................................................................. 24
1.4.7. Tác dụng trên dạ dày.................................................................................. 24
1.5. Những nghiên cứu về cây bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinenesis
Franchet).................................................................................................................... 24
1.5.1. Phân loại và đặc điểm hình thái bảy lá một hoa........................................ 24
1.5.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bảy lá
một hoa................................................................................................................. 25
1.5.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học................................................. 25


1.5.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học................................................... 26
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 28
2.2. Các phương pháp hóa học................................................................................... 28
2.2.1. Phương pháp phân lập các chất.................................................................. 28
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất............................................. 28
2.2.3. Phương pháp dấu vân tay hóa học............................................................. 29
2.3. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học............................................................ 30
2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào........................................ 30
2.3.2. Sử dụng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla để xác định hoạt độ của
hai yếu tố NF-κB và AP-1................................................................................... 31
2.3.3. Sử dụng kỹ thuật Western blot trong phát hiện biểu hiện của các protein
trong tế bào ung thư vú MCF-7........................................................................... 32

4.4.1. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp TLC......................................... 105
4.4.2. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp HPLC..................................... 109
4.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học............................................................................ 111
4.5.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư của cao chiết tổng, cao phân đoạn và
một số hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC......................................................... 111
4.5.2. Ảnh hưởng của hợp chất Paris II lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và
AP-1 bằng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla................................................. 115
4.5.3. Kết quả đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào ung
thư vú MCF-7 dưới tác dụng của hợp chất Paris II bằng kỹ thuật Western Blot......... 116
KẾT LUẬN..................................................................................................................... 120
KIẾN NGHỊ.................................................................................................................... 122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN................................................................................................................................123
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 124


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
NMR

Tiếng Anh
Nuclear Magnetic Resonance

Diễn giải
Phổ cộng hưởng từ hạt

Proton Nuclear Magnetic Resonance
spectroscopy
Carbon 13 Nuclear Magnetic



C-NMR

HMBC

H-1HCOSY
DEPT
DMSO

H-1H chemical Shift Correlation
Spectroscopy
Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Dimethyl sulfoxide

Mp

Hight Resolution Electron Spray
Ionization Mass Spectrometry
Electron Spray Ionization Mass
Spectra
Melting point

MeOH
EtOAc
DCM
EtOH

Methanol
Ethyl acetate


AP1

Activator protein 1

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide

LPS

Lipo polysaccharides

A549

Human lung cancer cells
Human promyelocytic leukemia
cells

HL-60

Yếu tố phiên mã AP1

Dòng tế bào ung thư phổi
Dòng tế bào ung thư bạch
cầu
Dòng tế bào ung thư cổ tử
cung

Hela


Paris caobangensis
Paris polyphylla var. yunnanensis

δH

Proton chemical shift

δC

Carbon chemical shift

s: Singlet

d: Doublet
m: Multiplet

Dòng tế bào ung thư trực
tràng
Dòng tế bào ung biểu mô
vú
Loài bảy lá một hoa được
trồng tại Sapa - Lào Cai
Loài bảy lá một hoa thu
hái tự nhiên tại Sapa Lào Cai

Độ chuyển dịch hóa học
của proton

t: Triplet

Bảng 4.6: Dữ liệu phổ của hợp chất RE3 và gracillin.....................................
Bảng 4.7: Dữ liệu phổ của hợp chất AB18......................................................
Bảng 4.8: Bảng dữ phổ của hợp chất AB19 và paris saponin II......................

71
75
80

Bảng 4.9: Dữ liệu phổ của hợp chất RE4 (500MHz, DMSO-d6)....................
Bảng 4.10: Dữ liệu phổ của hợp chất RE5 và paris saponin H.......................

85
89

Bảng 4.11: Dữ liệu phổ của hợp chất AB20 (500MHz, DMSO-d6)................
Bảng 4.12: Dữ liệu phổ của hợp chất AE12 (500MHz, MeOD) và resveratrol..
Bảng 4.13: Dữ liệu phổ của hợp chất AE13 và viniferin.................................
Bảng 4.14: Dữ liệu phổ của hợp chất AE11 và thymidin................................
Bảng 4.15: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao tổng và cao phân đoạn.......

93
100
102
104
111

Bảng 4.16: Giá trị IC50 của 8 hợp chất phân lập được PPC trên 4 dòng
tế bào ung thư................................................................................................... 112




51
52
53
55

Hình 4.7: Công thức cấu tạo của hợp chất AE 17............................................... 55
Hình 4.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất AE6......................................................... 56
Hình 4.9: Phổ 13C-NMR của hợp chất AE6........................................................ 57


Hình 4.10: Phân mảnh phổ ESI-MS hợp chất AE6............................................ 57
Hình 4.11: Tương tác HMBC trong cấu trúc phân tử hợp chất AE6.................. 58
Hình 4.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất AE6.................................................

59

Hình 4.13: Phổ 1H, DEPT và 13C-NMR của hợp chất RE1................................ 60
Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất RE1.................................................. 61
Hình 4.15: Phổ 13C-NMR của hợp chất AE16.................................................... 62
Hình 4.16: Tương tác các anome trên phổ HMBC của hợp chất AE16............ 63
Hình 4.17: Phổ COSY của hợp chất AE16......................................................... 63
Hình 4.18: Cấu trúc của hợp chất AE16 và tương tác HMBC (→) và COSY
(−) phần đường ................................................................................................... 65
Hình 4.19: Phổ NMR hợp chất AE15................................................................. 66
Hình 4.20: Cấu trúc hóa học của hợp chất AE15................................................ 68
Hình 4.21: Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 3................................................. 69
Hình 4.22: Tương tác của anome phần đường của hợp chất 3............................ 70
Hình 4.23: Phổ COSY của hợp chất 3................................................................ 70
Hình 4.24: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 và tương tác HMBC và COSY..... 72

cấu trúc phần đường.............................................................................................. 94
Hình 4.47: Phổ 1H-NMR của hợp chất 7.............................................................
Hình 4.48: Phổ 1H-NMR của hợp chất 9..............................................................
Hình 4.49: Phổ DEPT của hợp chất 9.................................................................
Hình 4.50: Phổ 1H-NMR của hợp chất 14...........................................................

96
97
98
98

Hình 4.51: Phổ DEPT của hợp chất 14............................................................... 99
Hình 4.52: Cấu trúc hóa học của hợp chất 14..................................................... 99
Hình 4.53: Phổ 1H-NMR của hợp chất 13........................................................... 101
Hình 4.54: Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất 13......................................... 101
Hình 4.55: Công thức cấu tạo của hợp chất 13................................................... 102
Hình 4.56: Phổ DEPT của hợp chất 11...............................................................
Hình 4.57: Phổ COSY, HMBC của hợp chất 11.................................................
Hình 4.58: Cấu trúc hóa học của hợp chất 11.....................................................
Hình 4.59: Sắc ký đồ bản mỏng các mẫu phần trên mặt đất chi Paris...............
Hình 4.60: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) các mẫu phần

103
103
104
105

dưới mặt đất chi Paris (Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01) )............. 106



dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng, tác
dụng trên dạ dày, tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần.
Về thành phần hóa học, các hợp chất đã được phân lập từ một số loài Paris bao
gồm saponin, flavonol, sphingolipid và các glycosid khác. Trong đó, nhóm cấu trúc
saponin được nghiên cứu nhiều nhất là saponin steroid (có trên 120 hợp chất) từ 22
loài thuộc chi Paris đã được công bố.
Ở Việt Nam, chi Paris là chi hiếm gặp và phân bố chủ yếu ở một số tỉnh miền
núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên - nơi có khí hậu mát, độ ẩm cao. Hiện nay, ở
nước ta có 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris gồm: Paris dunniana H.Lév., Paris fargesii
Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis Y.H.Ji, H.Li &
Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li &
Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var.
yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., và Paris polyphylla var. chinensis (Franch.)
H.Hara.). Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của một số loài thuộc chi Paris với
tên thường gọi bảy lá một hoa (hay thất diệp nhất chi hoa) được dùng để chữa sốt, sốt
rét cơn, giải độc nhất là khi bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao,
ho lâu ngày, hen suyễn. Dùng ngoài với tác dụng sát trùng những nơi bị sưng đau, vết
rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt [1].

1


Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nước ngoài, nhưng chủ yếu tập trung
trên đối tượng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối tượng Paris
polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây bảy lá một hoa Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam” góp phần xây dựng
cơ sở dữ liệu khoa học về loài này ở Việt Nam. Đề tài thực hiện với 2 mục tiêu chính
như sau:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis Franchet trồng tại
Lào Cai:

nhiệt độ trung bình năm 15-21OC, lượng mưa 1500 mm/năm. Năm 1999, Phạm Hoàng
Hộ được xem là người đầu tiên có những thống kê và mô tả đơn giản 5 loài thuộc chi
Paris nhưng chưa có khóa phân loại. Tác giả Nguyễn Thị Đỏ nghiên cứu về chi Paris
đầy đủ hơn với mô tả chi tiết và có khóa phân loại kèm hình vẽ của 6 loài là Paris
delavayi, P. polyphylla, P. dunniana, P. yunnanensis, P. chinensis, P. fargisii [2].
Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu phân loại một số loài thuộc chi Paris (họ
Trilliaceae) ở Việt Nam sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị PCR -RFLP” 2013-2015
[6], Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự (2015) đã bổ sung thêm 2 loài cho hệ thực vật Việt
Nam là Paris cronquistii (Takht.) H.Li và Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li &
Z.K.Zhou, đồng thời tách Paris vietnamensis (Takht.) H.Li thành loài riêng theo quan
điểm của H. Li (1984) vốn được Nguyễn Thị Đỏ (2007) coi là synonym của loài Paris
polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. – Mazz. Như vậy, theo kết quả nghiên
cứu Nguyễn Quỳnh Nga và cs tại Việt Nam có 8 loài và 2 thứ là: Paris dunniana
3


H.Lév., Paris fargesii Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis
Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li)
Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris
polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., Paris polyphylla var. chinensis
(Franch.) H.Hara. [5], [86], [87].
Ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Paris là những cây thuốc quý hiếm, có nguy cơ
tuyệt chủng. Nạn phá rừng làm thu hẹp môi trường sống và tình trạng thu gom bán qua
biên giới trong thời gian dài là nguyên nhân gây suy giảm mạnh nguồn cung cấp dược
liệu này. Hiện nay, loài Paris polyphylla var. yunnanensis Smith đã được đưa vào
Sách đỏ Việt Nam (2007) và danh mục cây thuốc Việt Nam (2006).
Đặc điểm thực vật của chi Paris L.
Cây thảo nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần thân trên
mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh hoặc hiếm khi phân nhánh, nảy mầm
vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá mọc vòng trên thân, 4-10 lá; phiến lá màu lục,

nhất là khi bị rắn độc cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày,
hen suyễn [1].
Liều dùng: ngày uống 4-12 g thân rễ dưới dạng thuốc sắc. Dùng ngoài với tác
dụng sát trùng, tiêu sưng, giã thân rễ đắp lên những nơi sưng đau, vết rắn cắn, tràng
nhạc, mụn lở, nhọt [1].
Ở Trung Quốc, các loài thuộc chi Paris được sử dụng chữa gẫy xương, chứng co
giật, cầm máu, điều tiết miễn dịch và sử dụng như là thuốc giảm đau, thuốc chống
viêm, thuốc hạ sốt, thuốc ho, thuốc kháng sinh, thuốc động kinh, thuốc thanh lọc cơ
thể [46, 110, 129, 135].
Ở Ấn Độ thân rễ loài P. polyphylla sử dụng trị giun sán và làm thuốc bổ [39].
Tại Nê Pan, các loài thuộc chi Paris được thu hái tự nhiên dùng làm thuốc trị
giun sán, bệnh dạ dày, làm long đờm [11].
1.3. Thành phần hóa học chi Paris
Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938 bởi Dutt và
cs [33] đã phân lập được 2 hợp chất parid và paristyphnin từ loài P. quadrifolia. Sau
đó năm 1983 [85] Nakano và Chen (1995) [20] công bố các hợp chất saponin,
flavonoid glycosid, sterol [14], [19] β-phytoecdyson và polysaccharid được công bố
lần lượt bởi Singh [104] và Zhou [135]. Cho đến nay có trên 100 saponin (xem hình
1.1) được phân lập từ các loài thuộc chi Paris gồm P. axialis, P. polyphylla var.
yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. delavayi Franch., P. vietnamensis, P.
dunniana, P. luquanensis, Paris polyphylla var. pseudothibetica, P. quadrifolia. Cấu
trúc của phần aglycon của các saponin phân lập được có khung steroid được mô tả như
hình 1.1. Hầu hết các aglycon liên kết với phần đường tại vị trí C-3, một số ít liên kết
với C-1.
1.3.1. Các hợp chất saponin
1.3.1.1. Các hợp chất saponin steroid
a. Các hợp chất saponin spirostan
Các saponin nhóm này thường có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin
hoặc là các dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C-24 hoặc C-27. Các
saponin này có từ 1 đến 4 đường và thường liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số



d. Các saponin steroid khác
Năm 2009, Xiao và cs phân lập được parispseudosid A và parispseudosid B
[121]. Hợp chất 18-norspirostanol được phân lập từ loài P. quadrifolia bởi
Nohara năm 1982 [88]. Năm 2016 Qin và cộng sự [96] đã phân lập được hai
sterol là 7α-hydroxy stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (117) và 7β-hydroxy
sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (118).

Hình 1.5: Một số saponin steroid khác (109 – 118) được phân lập
từ chi Paris

9


e. Các saponin polyhydroxyl hóa
O

R3H2C

OR 2
O OH
119.R=Xyl

OR1

O

HO
6

Rha

R2=D-Fuc R3=O-Gal

122.R1= Xyl

HO

3

Glc R2=L-Fuc
2
Rha
Glc R2=D-Fuc
2
Rha

O
OR 2
O OH

OR 1

3

123 .R= Xyl
124 .R= Xyl

HO



Tóm lại: Theo tổng hợp từ các tài liệu tham khảo, cho đến thời điểm hiện tại 125
hợp chất saponin sterol phân lập từ các loài thuộc chi Paris (xem bảng 1.1).
Bảng 1: Các saponin sterol phân lập từ chi Paris

Diosgenin

(1)

Trillin

(2)

Diosgenin-3-O-α-L-rha-(1→4)-βD-glc

(3)

Paris V

(4)

Polyphyllin C
Diosgenin-3-O-α-L-ara-(1→4)-βD-glc

(5)

Bộ phận phân lập,
loài
Thân lá PPY
Thân rễ PP,

Thân rễ Paris axialis,
thân lá PPY

Tài liệu
[95]
[95], [100],
[101]
[95], [100],
[101]
[80], [95]
[105]
[82]
[120]
[17]

(9)

Thân rễ PP

[105]

(10)

PPC

[124]

(11)
(12)


(17)

Thân rễ PP và P Y

Loureirosid

(18)

Thân rễ PP và PPY

(19)

Thân rễ PPC

[80]

(20)

Thân rễ PPY

[134]

(21)

Thân rễ PPY

[120]

Diosgenin-3-O-α-L-rha(1→4)-αL-rha(1→4)-β-D-glc
Diosgenin-3-O-β-D-glc-(1→5)α-L-Ara-(1→4)-[rha(1→2)]-β-Dglc

[82], [120]

(25)
(26)

Thân rễ PPC
Thân rễ PPC

[80]
[80]

(27)

Hạt PPY

[14]

Paris VII

(29)

Polyphyllosid
Pennogenin-3-O-β-D-xyl-(1→5)α-L-Ara-(1→4)-[rha(1→2)]-β-Dglc
Pennogenin-3-O-β-D-api-(1→3)[α-L-rha-(1→2)]-β-D-glc
Pennogenin-3-O-β-D-Glc(1→5)-α-L-Ara-(1→4)[rha(1→2)]-β-D-glc
Pennogenin-3-O-β-D-xl-(1→4)α-L-ara-(1→4)-[rha(1→2)]-β-Dglc
24α-hydroxyl-pennogenin-3-O-αL-rha-(1→3)-[α-L-rha-(1→2)]-βD-glc

(30)



(35)

PP

[56]

(28)

11

[80]
[19]
[77]