BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

Nguyễn Thị Duyên

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA – PARIS
POLYPHYLLA VAR. CHINENSIS THU THẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62 44 01 17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017


Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Đỗ Thị Hà
2. GS. TS. Phạm Quốc Long
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:


hợp chất) từ 22 loài thuộc chi Paris đã được công bố.
Ở Việt Nam, chi Paris là chi hiếm gặp và phân bố chủ yếu ở một số tỉnh
miền núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên - nơi có khí hậu mát, độ ẩm
cao. Cho đến nay đã phát hiện ở nước ta có 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris gồm:
Paris dunniana H.Lév., Paris fargesii Franch., Paris vietnamensis (Takht.)
H.Li, Paris caobangensis Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.)
H.Li, Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi
Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)
Hand. - Mazz., và Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H.Hara. Trong y
học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của một số loài thuộc chi Paris với tên thường
gọi bảy lá một hoa (hay thất diệp nhất chi hoa) được dùng để chữa sốt, sốt rét
cơn, giải độc nhất là khi bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho
lao, ho lâu ngày, hen suyễn. Dùng ngoài với tác dụng sát trùng những nơi bị
sưng đau, vết rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt [1].
Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nước ngoài, nhưng chủ yếu tập
trung trên đối tượng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối
tượng Paris polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn chính vì vậy chúng tôi


thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của
bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt
Nam”
2. Mục tiêu luận án:
Đề tài nghiên cứu thực hiện hai mục tiêu nghiên cứu sau:
Mục tiêu 1: Nghiên cứu thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis
Mục tiêu 2: Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của bảy lá một
hoa
3. Luận án đã thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu thành phần hóa học loài Paris polyphylla var. chinensis Franchet
trồng tại Lào Cai:

Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý:
điểm chảy, năng suất quay cực và các phương pháp phổ: phổ khối và phổ cộng
hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, và hai
chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY.
Phương pháp xác định dấu vân tay hóa học
Sử dụng phương pháp TLC và HPLC trong nghiên cứu đa dạng hóa học của các
mẫu thực vật thuộc chi Paris.
2.3. Các phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
2.3.1. Các phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Sử dụng phương pháp MTT theo mô hình Mosmann (1983), trên 4 dòng tế
bào ung thư: A549, HL-60, Hela và Caco-2. Sử dụng phần mềm chuyên dụng là
graphpad prism 5 để xác định giá trị IC50. Số liệu định lượng được trình dưới
dạng ± SE.
Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7
bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF): Tiến hành tương tự như phương pháp
MTT. Sử dụng phần mềm phân tích phương sai ANOVA để xử lý số liệu và sự
khác biệt được coi là có ý nghĩa khi p
Hiện màu tím đậm với thuốc hiện vanillin/ H2SO4 đặc, là hỗn hợp của 2 hợp chất RE2A
và RE2B
Hợp chất RE2A
1
H-NMR (CDCl3&CD3OD, 500 MHz) δH: 3,60 (1H, m, H-3), 5,24 (1H, brs, H-6),
0,72 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-19), 0,94 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21), 5,17 (1H, dd,
J=15,0; 8,5 Hz, H-22), 5,04 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz, H-23), 0,79 (3H, d, J= 7,0 Hz, H26), 0,87 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27), 0,80 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-29). Glc: 4,40 (1H, d, J=
7,5 Hz, H-1), 3,41 (1H, dd, J= 5,0; 8,5 Hz, H-2), 3,22 (1H, dd, J= 5,0; 8,5, Hz, H-3),
3,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, H-4), 3,29 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J= 12,0; 2,0 Hz, H-6a),
3,74 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6b).
13
C-NMR (CDCl3&CD3OD, 125 MHz), δC: 140,2 (C-5), 138,2 (C-22), 129,2 (C-23),
121,9 (C-6), 75,7 (C-3), 56,7 (C-14), 55,8 (C-17), 51,1 (C-24), 50,1 (C-9),42,1 (C-13),
40,3 (C-20), 39,6 (C-4), 38,5 (C-12), 37,1 (C-1), 36,5 (C-10), 31,7 (C-7), 31,7 (C-8),
31,7 (C-25), 29,4 (C-2), 28,7 (C-16), 25,2 (C-28), 24,2 (C-15), 20,9 (C-11), 20,9 (C-


21), 20,8 (C-27), 11,9 (C-29), 19,5 (C-19), 18,7 (C-26), 11,8 (C-18). Glc: 100,9 (C-1),
79,0 (C-3), 79,0 (C-5), 73,4 (C-2), 69,7 (C-4), 61,3 (C-6).
Hợp chất RE2B
1
H-NMR (CDCl3&CD3OD, 500 MHz), δH: 3,60 (1H, m, H-3), 5,04 (1H, brs, H6), 0,70 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-19), 0,94 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21), 0,81 (3H, d,
J= 7,0 Hz, H-26), 0,83 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27), 0,86 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-29). Glc:
4,40 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1), 3,41 (1H, dd, J= 5,0; 8,5 Hz, H-2), 3,22 (1H, dd, J= 5,0;
8,5, Hz, H-3), 3,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, H-4), 3,29 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J= 12,0;
2,0 Hz, H-6a), 3,74 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6b).
13
C-NMR (CDCl3&CD3OD, 125 MHz), δC: 140,2 (C-5), 121,9 (C-6), 75,7 (C-3), 56,6
(C-14), 55,9 (C-17), 50,1 (C-9), 45,7 (C-24), 42,2 (C-13), 39,5 (C-4), 38,5 (C-12), 37,1
(C-1), 36,5 (C-10), 35,7 (C-20), 33,8 (C-22), 31,7 (C-7), 31,7 (C-8), 29,4 (C-2), 29,0

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 5,35 (1H, H-6), 5,05 (1H, H-1Ara), 4,89 (1H, d, J
=2,0 Hz, H-1Rha), 4,43(1H, d, J =6,0 Hz, H-1Glc), 3,47 & 3,63 (2H, m, H-5Ara), 3,42
& 3,53 (2H, m, H-6Glc), 1,1 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,80 (3H,
d, J = 7,5 Hz, H-21), 0,75 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27), 0,74 (3H, s, H-18).
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 140,2 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C16), 88,3 (C-17), 76,3 (C-3), 65,8 (C-26), 51,9 (C-14), 49,5 (C-9), 44,3 (C-13), 43,6 (C20), 37,6 (C-4), 36,9 (C-1), 36,3 (C-10), 31,6 (C-12), 31,5 (C-8), 31,4 (C-15), 31,2 (C7), 30,8 (C-23), 29,7 (C-25), 29,0 (C-2), 28,0 (C-24), 20,0 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C18), 16,6 (C-27), 9,3 (C-21). Glc: 98,0 (C-1), 76,2 (C-4), 76,1 (C-5), 75,9 (C-2), 74,9
(C-3), 61,3 (C-6). Rha: 107,8 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-3), 70,4 (C-2), 67,9 (C-5), 17,7
(C-6). Ara: 100,0 (C-1), 84,5 (C-4), 81,4 (C-2), 76,5 (C-3), 60,0 (C-5).
Hợp chất AE6: dạng sáp màu vàng nhạt
1
H-NMR (500MHz, metanol-d4) δH: 5,37 (m, H 16, H9, H12, H13, H15&H10); 4,26 (d,
J=7,5 Hz, H1ʹ), 4,18 & 4,17 (dd, J=5,0&10,5 Hz, H-Sn1), 4,01 (m, H-Sn2), 3,68 & 3,93
(2H, dd, J=5,0, 10,5 Hz, H-Sn3), 3,74&3,54 (2H, m, H6ʹ), 0,99 ( t, J=7,5Hz).
13
C-NMR (125MHz, metanol-d4) δC: 175,4 (C1), 132,7 (C16), 131,0 (C9), 129,2 (C12),
129,2 (C13), 128,8 (C15), 128,1 (C10), 105,2 (C1ʹ), 76,7 (C3ʹ), 74,7 (C5ʹ), 72,5 (C2ʹ),
71,8 (Sn3), 70,2 (C4ʹ), 69,6 (C-Sn2), 66,5 (C-Sn1), 62,4 (C6ʹ), 34,9 (C2), 30,6 (C7),
30,2 (C6), 30,1 (C4), 30,1 (C5), 28,1 (C8), 26,5 (C11), 26,4 (C14), 25,9 (C3), 21,5
(C17), 14,7 (C18).
Hợp chất AE7: tinh thể hình kim màu trắng, mp. 168-170oC
1
H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 5,16 (1H, dd, J = 9,0,
15,5 Hz, H-22), 5,02 (1H, dd, J = 8,5, 15,0 Hz, H-23), 3,52 (m, H-3), 1,02 (3H, d, J =
6,5 Hz, H-21), 1,01 (3H, s, H-18), 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-29), 0,82 (3H, d, J = 7,5
Hz, H-28), 0,80 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-26).
Hợp chất AE8: bột trắng, mp. 219-221oC.
APCI-MS m/z: 431 [M+H]+
1
H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-6), 3,99 (1H, t, J = 7,5 Hz H16), 3,51 (1H, m, H-3), 1,03 (3H, s, H-19), 0,89 (3H, m, H-21), 0,82 (3H, s, H-18), 0,80
(3H, J = 6,5Hz, H-27).

6,83 (1H, 16,3 Hz, H-a), 6,96 (1H, d, 16,3 Hz, H-b).
13
C-NMR (500 MHz, metanol-d4) δC: 141,3 (C-1), 105,8 (C-2, C-6), 159,6 (C-3, C-5),
102,7 (C-4), 130,4 (C-1′), 128,8 (C-2′, C-6′), 116,5 ( C-3′, C-5′), 158,3 (C-4′), 127,0 (Ca), 129,4 (C-b).
Hợp chất AE13 (PE31)
1
H-NMR (500 MHz, metanol-d4) δH: 7,17 (2H, d, J=9,0 Hz, H2, H6), 7,06 (2H, d,
J=8,5 Hz, H2ʹ, H6ʹ), 6,84 (1H, d, J=16,0 Hz, H-7ʹ), 6,79 (2H, d, J=8,5 Hz, H3, H5),
6,67 (2H, d, J=8,5 Hz, H3ʹ, H5ʹ), 6,65 (1H, d J=2,0 Hz, H-14ʹ), 6,59 (1H, d, J=16,0 Hz,
H8ʹ), 6,27 (1H, d, J=1,5 Hz, H-12ʹ), 6,21 (1H, t, J=2,0 Hz, H-12), 6,19 (2H, d, J=2,0
Hz, H10, H14), 5,39 (1H, d, J=6,5 Hz, H-7), 4,37 (1H, d, J=6,5 Hz, H8).
13
C-NMR (125 MHz, metanol-d4) δC: 162,8 (C-11ʹ), 160,0 (C-11&C-13), 159,6 (C13ʹ),
158,4 (C4ʹ), 158,3 (C4), 147,3 (C9), 137,0 (C9ʹ), 133,9 (C1), 130,4 (C7ʹ), 129,9 (C1ʹ), 128,8
(C2ʹ&C6ʹ), 128,2 (C2&C6), 123,7 (C8ʹ), 120,1 (C10ʹ), 116,4 (C3ʹ&C5ʹ), 116,3 (C3&C5),
107,5 (C10&C14), 104,4 (C14ʹ), 102,3 (C12), 96,9 (C12ʹ), 94,8 (C7), 58,3 (C8).
Hợp chất AE14 (PE34): bột màu vàng, mp. 181-183OC
1
H-NMR (500MHz, metanol-d4) δH: 7,35 (1H, d, J=2,0Hz, H-2΄), 7,32 (1H, dd, J=2,0,
8,5Hz, H-6΄), 6,93 (1H, d, J=8,5Hz, H-5΄), 6,37 (1H, d, J=1,5Hz, H-8), 6,21 (1H, d,
J=1,5Hz, H-6), 5,37 (1H, d, J=1,0Hz, H1''), 4,87 (1H, H-4''), 4,24 (1H, br d, J=3,0, H2''), 3,76 (1H, dd, J=3,0, 9,0Hz, H-3''), 3,33 (1H, m, H-5''), 0,96 (3H, d, J=6,0Hz, H-6'').
13
C-NMR (125MHz, metanol-d4) δC: 179,6 (C4), 165,8 (C7), 163,1 (C5), 158,5 (C9),
158,3 (C2), 149,7 (C4'),146,4 (C3'), 136,2 (C3), 122,9 (C1'), 122,9 (C6'), 116,9 (C5'),
116,4 (C2'), 105,9 (C10), 103,5 (C1''), 99,8 (C6), 94,7 (C8), 73,3 (C4''),72,1 (C2''), 72,0
(C3''), 71,9 (C5''),17,6 (C6'')
Hợp chất AE15 (PE 25): bột màu trắng, ESI-MS (m/z) 722 [M-H]1
H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 3,46 (1H, d, J=5,5Hz, H-3), 5,32 (1H, H-6), 0,74
(3H, s, H-18), 0,97 (3H, s, H-19), 0,91 (3H, d, J=7,0Hz, H-21), 0,73 (3H, d, J=4,5Hz,
H-27), 4,27 (1H, d, J=8,0Hz, H-1Glc), 3,75&3,40(2H, m, H-6Glc), 4,70 (1H, H-1Rha),

H-18).
13
C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,4 (C-5), 121,4 (C-6), 108,4 (C-22), 80,0 (C16), 76,1 (C-3), 70,1 (C-12), 66,0 (C-26), 52,6 (C-17), 47,2 (C-14), 44,0 (C-13), 43,4
(C-9), 41,3 (C-20), 37,5 (C-4), 36,7 (C-1), 36,1 (C-10), 31,5 (C-15), 31,1 (C-8), 31,0
(C-23), 30,0 (C-2), 29,9 (C-25), 28,5 (C-24), 28,2 (C-11), 18,8 (C-19), 16,6 (C-27),
16,0 (C-18), 14,4 (C-21). Glc: 97,8 (C-1), 85,0 (C-3), 77,2 (C-2), 76,4 (C-5), 69,0 (C4), 60,8 (C-6). RhaI: 101,0 (C-1), 71,8 (C-4), 70,6 (C-3), 70,5 (C-2), 68,9 (C-5), 17,8
(C-6). RhaII: 102,0 (C-1), 71,3 (C-4), 70,5 (C-3), 70,5 (C-2), 68,5 (C-5), 17,7 (C-6).
Hợp chất AB18 (PE 36): Tinh thể màu trắng đục, mp. 274-276 OC.
APCI-MS: m/z = 903,6 [M+Cl]-.
1
H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, H-6), 5,02 (1H, H-RhaI), 4,39 (1H, d, J =
8,0 Hz, H-Glc), 4,93 (1H, H-RhaII), 3,57 & 3,41 (2H, m, H-Glc), 3,38 (1H, m, H3),
1,10 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6RhaII), 1,09 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-RhaI), 0,96 (3H, s, H19), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,73 (d, J = 5,5 Hz, 3H), 0,73 (3H, s, H-18).
13
C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,2 (C-6), 108,4 (C-22), 80,2 (C16), 76,3 (C-3), 65,9 (C-26), 61,8 (C-17), 55,8 (C-14), 49,6 (C-9), 41,1 (C-20), 40,0 (C13), 39,0 (C-12), 37,4 (C-4), 36,8 (C-1), 36,4 (C-10), 31,5 (C-7), 31,5 (C-15), 31,0 (C-


8), 30,9 (C-2), 29,8 (C-25), 29,0 (C-23), 28,5 (C-24), 20,4 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C18), 16,0 (C-21), 14,6 (C-27). Glc: 98,2 (C-1), 77,0 (C-2), 76,8 (C-4), 76,1(C-5), 75,2
(C-3), 60,1(C-6). RhaI: 100,3 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-3), 70,4 (C-2), 68,0 (C-5), 17,8
(C-6). RhaII: 100,5 (C-1), 71,9 (C-4), 70,7 (C-2), 70,6 (C-3), 68,7 (C-5), 17,7 (C-6).
Hợp chất AB19 (PE22): bột màu trắng, mp. 203-206 C
: -91,8 (c 0,0055, pyridine)
HR-ESI-MS m/z 1015,5472 (M+H)+, 1037,5292 (M+Na)+
1
H-NMR (500 MHz, pyridin-d5) δH: 6,43 (1H, br s, H-1RhaI), 6,31 (1H, d, J = 1,0 Hz,
H-1RhaIII), 5,82 (1H, br s, H-1RhaII), 5,33 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 4,97 (1H, d, J =
7,5 Hz, H-1Glc), 4,25 & 4,2 (2H, m, H-6Glc), 1,79 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6RhaI), 1,63
(3H, d, J = 3,0 Hz, H-6RhaIII), 1,61 (3H, d, J = 3 Hz, H-6RhaII), 1,16 (3H, d, J = 7,0
Hz, H-21), 1,07 (3H, s, H-19), 0,85 (3H, s, H-18), 0,72 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27).
13

saponin VII (AB20) được tiến hành pha trong MeOH với nồng độ 1 mg/ml. Các
mẫu được cho vào lọ sắc ký HPLC 1 ml, để tiến hành sắc ký TLC và HPLC.
Tiến hành TLC xây dựng dấu vân tay hóa học được lập chương trình tiêm
mẫu tự động trên máy Linomat 5.0.
Tiến hành HPLC xây dựng dấu vân tay hóa học
Tiến hành khảo sát chương trình chạy và tham khảo các tài liệu tiến hành với mẫu
có saponin steroid hệ dung môi chạy HPLC là: axetonitril (A)- axid phosphoric
0,1% nước (B); tốc độ dòng: 1ml/phút; bước sóng phát hiện: 205 nm và nhiệt độ
cột là 300C
Kết quả được trình bày như trong phần 4.2
3.4. Hoạt tính sinh học
3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT
a. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT
Tiến hành trên 8 mẫu cao phân đoạn và 8 hợp chất tinh khiết spirostan steroid
phân lập từ PPC gồm: RE1, RE3, RE4, RE5, AE8, AB18, AB19 và AB20.
Kết quả được trình bày ở phần 4.3.1
b. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 bổ sung EGF
Tiến hành trên 8 mẫu cao phân đoạn và 6 hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC.
Kết quả được trình bày ở phần 4.3.1
3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của paris saponin II lên hoạt độ của hai yếu tố phiên
mã NF-κB và Ap-1 gây bởi yếu tố kích thích viêm LPS trong đại thực bào
RAW 264.7.
Tiến hành các bước như trong kít luciferase (Promega, WI), có sử dụng yếu tố
kích thích viêm LPS trong đại thực bào RAW 264.7. Thiết bị đo cường độ sáng
Luminometer (LB941, Berthold Technologies) xác định hoạt độ của enzym
luciferase. Thông qua mức độ hoạt độ của luciferase cho quy đổi hoạt độ tương
đương của hai yếu tố NF-κB và Ap-1.
Phép thử tiến hành tại các nồng độ hợp chất paris saponin II: 1, 3, 10, 30 µM
(-): Chứng âm không bổ sung LPS và mẫu thử.
(+): Chứng dương có bổ sung LPS và không bổ sung mẫu thử.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phần dƣới mặt đất
PPC
Từ phần trên mặt đất bảy lá một hoa phân lập và xác định cấu trúc hóa học 15
hợp chất (AE6-AB20) trong đó 1 hợp chất mới (AB17) và 7 hợp chất lần đầu
tiên phân lập từ PPC là: 1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol
(AE6), stigmasterol (AE7), quercetin (AE9), thymidine (AE11), resveratrol


(AE12), ε-viniferin (AE13), quercetrin (AE14), và các hợp chất khác:
penogenin (AE8), stigmasterol-3-O-D-glucosid (AE10), diosgenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glycopyranosid (AE15), diosgenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glycopyranosid (AE16), dioscin (AB18), paris
saponin II (AB19), paris saponin VII (AB20).

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phần trên mặt đất PPC
Biện giải cấu trúc hợp chất AB17 (Hợp chất mới)
Hợp chất 17: phân lập có dạng bột màu trắng, có nhiệt nóng chảy 167-169OC.
Phổ 1D-NMR phần aglycon cho các tín hiệu đặc trưng của spirostan steroid 4
nhóm metyl trong đó có hai nhóm có tín hiệu singlet tại δ 0,71 (s), 0,93 (s) và
hai tín hiệu douplet tại δ 0,88 (d, J=7,0 Hz), 0,73 (d, J=6,5 Hz); một proton thế
ba lần tại δ 5,33 (d, J=4,5Hz); và tín hiệu proton nhóm oxymetin tại δ 3,5 (H-3)
và 27 cacbon trên phổ 13C-NMR với 1 cacbon spirostan tại δ 108,4. Mặt khác,
tín hiệu hai nhóm metin tại δ 80,0 (C-16) và 52,6 (C-17) gợi ý dạng cấu trúc
spirostan này là diosgenin. Vị trí của cacbon được xác định bằng tương tác
H→C trực tiếp trên phổ HSQC gồm 4 nhóm metyl tại δ 16,0, 18,8, 14,4 và
16,6, một nối đôi thế ba lần tại δ 121,4 (C6) và 140,4 (C5); một nhóm oxymetin
tại C3 (δ 76,1). Tuy nhiên, khi so sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất
AB17 với dioscin (dioscin là một saponin diosgenin với 3 phân tử đường) và
hợp chất (25R)-spiros-5-ene-3β, 12α-diol3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)[α-L-Rha(1→2)]-β-D-Glc có một số khác biệt:
Dữ liệu phổ 1D-NMR cuả dioscin và hợp chất AB17 (xem bảng 4.1) cho các tín
hiệu tương tự nhau chỉ khác tại một số điểm như dioscin có 10 nhóm metylen
trong khi hợp chất AB17 chỉ có 9 nhóm và thiếu một tín hiệu nhóm này δ tại

2D-NMR và HR-ESI-MS thực
nghiệm kết hợp với so sánh dữ
liệu phổ tài liệu có thể kết luận
hợp chất AB17 là 12-hydroxydiosgenin-3-O-α-LCông thức cấu tạo của hợp chất AB17
rhamnopyranosyl-(1→2)-[α(12-hydroxy-diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosylL-rhamnopyranosyl-(1→3)](1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-Dβ-D-glucopyranosid
glucopyranosid)


Tham chiếu cấu trúc của hợp chất AB17 trên phần mềm scifinder không tìm
thấy cấu trúc nào tương tự nên có thể kết luận hợp chất này là hợp chất mới
trong tự nhiên cũng như trong tổng hợp hữu cơ.
4.2. Xây dựng dấu vân tay hóa học các mẫu thuộc chi Paris
4.2.1. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp TLC
Chuẩn bị mẫu cao và pha tinh khiết phân lập từ PPC như phần 3.3, tiến hành mã hóa
các mẫu và thực hiện TLC trên máy chấm sắc ký Linomat 5.0 thu được sắc ký đồ sau:
Kết sắc ký đồ phần trên mặt đất các mẫu chi Paris
B

A

C

D

Trong đó:
1
2
3
4
5

gracillin, paris saponin D và paris saponin H; 2 chất tinh khiết phân lập từ phần trên mặt
đất là paris saponin II và paris saponin VII. Kết quả sắc ký đồ cho thấy các chất tinh
khiết không phát hiện tại UV 254 và 366 nm và chỉ phát hiện với thuốc thử H2SO4 10%
trong cồn tuyệt đối và hơ nóng; các hệ dung môi cho sự phân tách của các chất tinh
khiết khá tốt:
+ Đối với phần trên mặt đất hai chất paris saponin II và paris saponin VII
có sự phân bố tỉ lệ nghịch trên các mẫu thực vật.
+ Đối với phần dưới mặt đất nên sử dụng cả TLC trên pha đảo và pha
thường để phân tích sắc ký đồ của 3 chất tinh khiết. Kết quả sắc ký đồ trên 6
mẫu thực vật có sự khác biệt và hoàn toàn có thể sử dụng TLC để phân biệt các


loài và dưới loài.
A

B

C

D

E

F

A: Sắc kýđồ trên silica gel 60 F254, Hệ dungmôi:
CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01), ánh sáng thường
B: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O
(2/1/0,01), bước sóng 366nm
C: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1),

Chuẩn bị mẫu cao và các chất tinh khiết như phần phần 3.3 thu được kết quả
sắc ký đồ phần trên và dưới mặt đất:

Sắc ký đồ HPLC của các mẫu phần trên
mặt đất chi Paris

Sắc ký đồ HPLC của các mẫu phần thân
rễ chi Paris


Trong đó:
Hợp chất paris saponin VII (AB20)
Hợp chất paris saponin II (AB19)
Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris
vietnamensis (PV)
4. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris
polyphylla var. polyphylla (PPP)
5. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris
caobangensis (PC)
6. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris
polyphylla var. yunnanesis (PPY)
7. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris
polyphylla var. chinensis được trồng Sapa- Lào Cai
(PPC)
Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris
polyphylla var. chinensis thu hái tự
1.
2.
3.


Đối với phần dưới mặt đất:
+ Hai chất paris saponin D và gracillin là hai saponin chính trong các mẫu
thuộc chi Paris. Paris saponin H có trong các mẫu nhưng lượng nhỏ hơn.
+ Khi so sánh sự tích lũy của 3 chất tinh khiết này trong mẫu PPC trồng và
thu hái tự nhiên có sự khác nhau theo chiều hướng loài hoang dại tích lũy cao hơn.
Kết quả này phù hợp với sắc ký đồ bằng phương pháp TLC.
+ Số lượng các pic chất của các mẫu thuộc chi Paris cũng có sự khác biệt
theo thứ tự: PPCW>PPC, PPY, PV và ít nhất trong mẫu PPP.
4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học
4.3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao chiết, các cao phân
đoạn và 8 hợp chất spirostan steroid tinh khiết phân lập từ PPC trên 4 dòng tế
bào A549, HL-60, Hela và Caco-2. Sử dụng Adriamycin làm chứng dương
Giá trị IC50 của cao tổng, cao phân đoạn và 8 hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC
Ký hiệu mẫu

IC50 (µg/ml)


A549

HL-60

Hela

Caco-2

RPC

10,46 ±0,76


18,59 ±0,98

9,144 ±0,43

22,7 ±1,56

PC

7,76 ±0,63

13,46 ±0,89

8,41 ±0,54

20,19 ±1,36

PCEt

9,33 ±0,65

11,77 ±0,97

9,24 ±0,68

8,23 ±0,43

PCBt

10,54 ±0,98


14,80 ± 1,12

19,24 ± 1,05

39,50 ± 1,04

Paris saponin H

30,76 ± 1,01

19,41 ± 1,09

10,96 ± 1,05

43,59 ± 1,25

Paris saponin VII

35,86 ± 1,23

13,06 ± 1,21

13,17 ± 1,14

26,01 ± 1,17

Diosgenin

17,09 ± 0,50


52,98 ± 1,32

13,46 ± 1,17

37,28 ± 1,19

Adriamycin

0,95 ± 0,09

0,54 ± 0,07

0,31 ± 0,01

2,04 ± 0,35

Trong đó:
RPC: Mẫu cao tổng phần thân rễ; RPCBt: Mẫu cao phân đoạn butanol phần thân rễ; RPCEt:
Mẫu cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ; RPCW: Mẫu cao phân đoạn nước phần thân rễ; PC:
Mẫu cao tổng phần trên mặt đất; PCEt: Mẫu cao phân đoạn etyl axetat phần trên mặt đất; PCBt:
Mẫu cao phân đoạn butanol phần trên mặt đất; PCW: Mẫu cao phân đoạn nước phần trên mặt đất.

Nhân xét:
Cao tổng phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất có tác dụng gây độc 3
dòng tế bào ung thư A549, Hela và HL-60 với giá trị IC50 từ 7,56 - 15,55
µg/mL, không có tác dụng trên Caco-2 (giá trị IC50 > 20 µg/mL). Hoạt tính gây
độc tế bào ung thư của phần trên mặt đất mạnh hơn cả phần dưới mặt đất kết
quả này cho thấy có thể dùng thay thế phần thân rễ bằng phần trên mặt đất
trong nghiên cứu ung thư.

tế
bào

-

+

1

2

3

4

5

6

7

8

9

50 µg/ml

10

11 12 13 14

acxetat phần dưới mặt đất; (4): Cao phân đoạn nước phần dưới mặt đất; (5): Cao tổng phần trên
mặt đất; (6): Cao phân đoạn butanol phần trên mặt đất; (7): Cao phân đoạn etyl axetat phần trên
mặt đất; (8): Cao phân đoạn nước phần trên mặt đất; (9): diosgenin; (10): paris saponin D; (11):
gracillin; (12): paris saponin H; (13): paris saponin II; (14): paris saponin VII.

Nhận xét:
Tại nồng độ thử là 50 µg/ml cao tổng, cao phân đoạn butanol, cao phân đoạn
nước phần trên và phần dưới mặt đất không cho tác dụng ức chế tăng sinh tế
bào ung thư vú có bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) (mức độ sai khác
có ý nghĩa thông kê là 0), nhưng phân đoạn etyl axetat của phần trên và phần
dưới mặt đất đều thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 (mức độ sai
khác có ý nghĩa thống kê là 0,5 và 0,05). Sự khác biệt không có ý nghĩa giữa
phần trên mặt đất, dưới mặt đất.
Tại nồng độ thử là 30 µg/mL 6 hợp chất spirostan saponin tinh khiết phân
lập từ PPC đều thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào MCF-7, nhưng paris
saponin II thể hiện hoạt tính cao nhất với khả năng ức chế tăng sinh MCF-7
giảm 2,2 lần so với đối chứng dương và đạt độ tin cậy so sánh là 0,005. Trên
mô hình thử ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú có bổ sung EGF, diosgenin thể


hiện khả năng ức chế tăng sinh tế bào yếu hơn so với các saponin tương ứng
của nó.
Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của paris saponin II đến khả năng ức chế
tăng sinh tế bào MCF-7 cho thấy: hợp chất này ức chế tăng sinh tế bào ung thư
vú phụ thuộc vào nồng độ và tại nồng độ 30 µM thể hiện khả năng ức chế tăng
sinh tế bào này mạnh nhất và gần bằng đối chứng âm. Mặt khác, các nghiên cứu
sâu về cơ chế tác động của hợp chất này cho đến nay chưa có công bố nào.
Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn hợp chất paris saponin II để nghiên
cứu cơ chế tác dụng trên một số đích phát sinh ung thư.
4.3.2. Kết quả tác dụng của hợp chất paris saponin II lên hoạt độ của hai yếu tố

1 3 10 30
+ LPS 5 ng/ml

paris II
(µM)

Ảnh hƣởng của paris saponin II (paris II) lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và Ap-1
Ghi chú: (-): Chứng âm không có LPS; (+): Chứng dương bổ sung LPS.

Nhận xét:
Kết quả hình trên cho thấy hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và Ap-1 ở mẫu
chứng dương khi tế bào RAW246.7 bị kích thích viêm bởi 5 ng/ml
lipopolysaccharid (LPS) thì hoạt độ của cả hai yếu tố phiên mã NF-κB và Ap-1
tăng khoảng 4 lần so với mẫu chứng âm với độ tin cậy là 0,001 đã khẳng định
tính đúng của mô hình. Paris saponin II làm giảm hoạt độ của của NF-κB và Ap1 khi có mặt LPS phụ thuộc nồng độ và ức chế mạnh nhất tại nồng độ 30 µM.
4.3.3. Kết quả biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF-7 sử
dụng kỹ thuật Western Blot.


p27
p21

Cyclin D1
p-Rb

Rb
E2F1

β-actin


dụng làm tăng biểu hiện hai protein Bax và p53 phụ thuộc theo nồng độ 1, 3, 10
µM và nồng độ 30 µM không thấy tác dụng. Kết quả phân tích vai trò của hai
protein này đối với quá trình apoptosis cho thấy: chất paris saponin II có tác
động trực tiếp và gián tiếp thúc đẩy quá trình apoptosis.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.
Về thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis Franchet
trồng tại Lào Cai.
1.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.
Từ cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ bảy lá một hoa (PPC) đã phân 6 hợp
chất tinh khiết (RE1, RE2A và RE2B, RE3 – RE5) gồm: diosgenin (RE1), hỗn
hợp hai chất stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (RE2A) và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid (RE2B), gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin
H (RE5).
Từ cao phân đoạn etyl axetat và butanol phần trên mặt đất loài PPC phân lập
được 15 hợp chất tinh khiết (AE6 – AB20): trong đó có 1 hợp chất mới là 12-


hydroxy-diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→3)]-β-D-glucopyranosid (AB17), 5 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Paris
gồm 1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol (AE6),
stigmasterol
(AE7), thymidin (AE11), resveratrol (AE12), ε-viniferin (AE13); 2 hợp chất lần
đầu tiên phân lập từ PPC gồm quercetin (AE9), quercetrin (AE14); và 7 hợp chất
khác là pennogenin (AE8), stigmasterol-3-O-D-glucosid (AB10), diosgenin-3-O-αL-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glycopyranosid (AE15), diosgenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glycopyranosid (AE16), dioscin (AB18), paris
saponin II (AB19), và paris saponin VII (AB20).
1.2. Bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học để phân biệt một số loài thuộc chi
Paris.
Đề tài đã bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học bằng phương pháp TLC và
HPLC. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về thành phần hóa học giữa các loài
thuộc chi Paris thu ở Việt Nam. Mặt khác, thông qua tín hiệu píc của các hợp
chất trên sắc ký đồ bản mỏng và HPLC, sự có mặt của các hợp chất của loài

chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 trong điều kiện có bổ sung yếu tố tăng
trưởng biểu bì (EGF). Trong đó, hợp chất paris saponin II thể hiện tác dụng ức
chế tăng sinh tế bào mạnh nhất tại liều thử nghiệm.
+ Hợp chất paris saponin II ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 khi bổ
sung EGF phụ thuộc nồng độ, tại nồng độ 30 µM ức chế mạnh nhất.
Đề tài cũng đã lần đầu tiên đánh giá ảnh hưởng của hợp chất paris saponin II
lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và AP-1 bằng kỹ thuật phân tích luciferase
Renilla:
Hợp chất Paris saponin II làm giảm hoạt độ NF-kB và Ap-1 khi bổ sung chất
kích thích gây viêm lipopolysaccharide (LPS) trong đại thực bào RA W264.7 phụ
thuộc nồng độ, tại nồng độ 30 µM có tác dụng mạnh nhất.
Đề tài đã lần đầu tiên đánh giá mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào
ung thư vú MCF-7 theo nồng độ hợp chất paris saponin II bằng kỹ thuật
Western Blot.
+ Đối với nhóm các protein tham gia chu trình tế bào: Hợp chất paris saponin
II có tác dụng làm tăng biểu hiện p21 và p27 và giảm biểu hiện cyclin D1 và pRb phụ thuộc nồng độ và không làm thay đổi mức độ biểu hiện Rb và E2F1.
Với tác dụng này có thể nghĩ đến hợp chất paris saponin II ức chế tế bào ung
thư ở pha G1 của chu trình nhân lên của tế bào ung thư.
+ Đối với protein tham gia quá trình apoptosis: Hợp chất paris saponin II tác
dụng làm tăng biểu hiện hai protein Bax và p53 phụ thuộc theo nồng độ 1, 3, 10
µM và nồng độ 30 µM không thấy tác dụng. Với tác dụng này có thể nghĩ đến paris
saponin II có tác dụng thúc đẩy sự chết theo chu trình của tế bào ung thư
(apoptosis).

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1.
Luận án đã thành công trong viêc phân lập được 21 chất gồm: RE1
(diosgenin); RE2 hỗn hợp hai chất stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và βsitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid), RE3 (gracillin), RE4 (paris saponin D), RE5
(paris saponin H), AE6 (1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol), AE7
(stigmasterol), AE8 (pennogenin), AE9 (quercetin), AE10 (stigmasterol-3-O-Dglucosid), AE11 (thymidin), AE12 (resveratrol), AE13 (ε-viniferin), AE14