1

mục lục
Trang
B
5

Đặt vấn đề

1

Phần I - Tổng quan

3

1.1. Giới thiệu về Clenbutrol

3

1.1.1. Cấu tạo, tính chất Clenbuterol

3

1.1.2. Tác dụng dược lý, độc tính

4

B
0

1.1.3. Thực trạng tình hình sử dụng Clenbuterol hiện nay


16

1.3.2. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

17

1.3.3. Phương pháp vi chiết pha rắn (SPME)

27

1.4. Xử lý số liệu phân tích

28

Phần II - Đối tượng - Nội dung và phương pháp nghiên
cứu

29

2.1. Thiết bị, hoá chất

29

2.1.1. Thiết bị

29

2.1.2. Dụng cụ, hoá chất


Phần III - Thực nghiệm và kết quả

33

3.1. Xây dựng chương trình phân tích trên GC-MS

33

3.2. Phân tích định tính

34

3.3. Điều kiện dẫn xuất hoá

37

3.3.1. Nhiệt độ dẫn xuất hoá

37

3.3.2. Thời gian dẫn xuất hoá

38

3.3.3. Thể tích chất dẫn xuất

39

B
1

3.5. Thẩm định phương pháp

48

3.5.1. Khoảng nồng độ tuyến tính

48

3.5.2. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp

49

3.5.3. Xác định giới hạn định lượng của phương pháp

52


3

3.6. Phân tích Clenbuterol trên mẫu nước tiểu thỏ thực
nghiệm

54

3.6.1. Phương pháp lấy mẫu

54

3.6.2. Phân tích và kết quả


Bảng 3.4. Độ ổn định của phản ứng dẫn xuất hoá CLB ................................... 41
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc giữa lượng dung môi rửa với khả năng rửa trôi CLB . 44
Bảng 3.6. Độ thu hồi CLB theo các phân đoạn thể tích dung môi rửa giải ...... 45
Bảng 3.7. Độ thu hồi CLB trên cột chiết pha rắn SCX ..................................... 46
Bảng 3.8.Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của CLB - TMS ............ 48
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát giới hạn định lượng ............................................. 52
Bảng 3.10 . Kết quả phân tích CLB trong nước tiểu thỏ theo từng ngày với
liều uống 0,8 àg/kg .......................................................................................... 55
Bảng 3.11 . Kết quả phân tích CLB trong nước tiểu thỏ theo từng ngày với
liều uống 3,2 àg/kg .......................................................................................... 57


5

Danh mục hình
Hình 1.1. Sơ đồ thiết bị sắc kí khí ...................................................................... 9
Hình 1.2. Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn .............................. 26
Hình 3.1. Các ion nhận dạng CLB - TMS .......................................................... 34
Hình 3.2. Sắc kí đồ và khối phổi của CLB - TMS chuẩn.................................... 35
Hình 3.3. Sắc kí đồ và khối phổi của CLB - TMS, sản phẩm thu được từ thực
nghiệm ................................................................................................................ 36
Hình 3.4. Mối liên hệ giữa nhiệt độ và diện tích pic .......................................... 38
Hình 3.5. Mối liên hệ giữa thời gian phản ứng và diện tích pic ......................... 38
Hình 3.6. Mối quan hệ giữa thể tích MSTFA và diện tích pic............................ 41
Hình 3.7. Phổ khối của CLB - TMS dạng SIM ................................................... 42
Hình 3.8. Quy trình chiết CLB từ nước tiểu thỏ cho phân tích trên GC - MS .... 47
Hình 3.9. Mối quan hệ giữa nồng độ CLB và diện tích pic CLB - TMS ............ 49
Hình 3.10. Sắc kí đồ của CLB - TMS ở giới hạn phát hiện ................................ 51
Hình 3.11. Sắc kí đồ của CLB - TMS ở giới hạn định lượng .............................. 53



Chiết lỏng - lỏng

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MSTFA

N - methyl - N - (Trimethylsily1) Trifluoroacetamid

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SPE

Chiết pha rắn

SPME

Vi chiết pha rắn

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

cứu xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng clenbuterol trong


8

dịch sinh học động vật" nhằm bước đầu cung cấp dữ liệu thực nghiệm phục
vụ công tác giám định doping và kiểm nghiệm thực phẩm. Để đạt được
những mục tiêu trên nội dung bản luận văn thực hiện gồm:
Xây dựng quy trình chiết pha rắn clenbuterol trong mẫu nước
tiểu.
Xây dựng chương trình phân tích clenbuterol bằng sắc kí khí
khối phổ.
Định lượng clenbuterol trong nước tiểu thỏ thực nghiệm cho
uống clenbuterol.


9

Phần i

Tổng quan
1.1. Giới thiệu về Clenbuterol.
1.1.1. Cấu tạo, tính chất Clenbuterol
- Công thức cấu tạo:
CH3
CH CH2 NH C CH3
OH

CH3


mỗi

100mL

có:

Ambroxol.HCl

150

mg

và

Clenbuterol.HCl 100 àg.
Roxobronic (Hawon Pharm)
Dạng viên nén thành phần gồm: Ambroxol.HCl 30 mg
Clenbuterol.HCl 20àg
Do những tác dụng phụ nên Clenbuterol đã bị cấm sử dụng
trong y học.
Trong thú y, CLB được sử dụng phổ biến để điều trị rối loạn hô hấp
do dị ứng cho ngựa. Thương hiệu Ventifulmin do Ingelheime (Đức) sản
xuất có mặt ở khắp nơi.
Tuy nhiên CLB bị lạm dụng trong hoạt động thể thao, trong chăn
nuôi. Clenbuterol làm tăng khả năng chuyển hoá tổng hợp protein, giảm
tích mỡ (nạc hoá trong chăn nuôi lợn, bò, gà ...). Song clenbuterol lại có tác
dụng phụ rất hại cho sức khoẻ con người sau khi sử dụng hoặc ăn phải thực
phẩm tồn dư clenbuterol như gây tổn hại chức năng gan, gây rối loạn nhịp
tim, tăng huyết áp, phù nề, tuỳ theo thể trạng của từng người [11], [22].



12

Nông thôn Việt Nam đã quy định cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử
dụng trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi, trong đó có chất
clenbuterol. Theo kết quả phân tích của Viện Khoa học Kỹ thuật nông
nghiệp Miền Nam ngày 5/12/2006, trong 86 mẫu máu lợn khi giết mổ tại
Thành phố Hồ Chí Minh, phát hiện gần 20% chứa -agonist, phổ biến nhất
là clenbuterol - chất có thể gây tai biến tim. Các nhà khoa học cũng khẳng
định: "nếu có trong máu, chất này chắc chắn có trong thịt lợn". Như vậy
hiện nay ở Việt Nam có sử dụng clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi [5],
[10], [13], [18].
1.2. Một số phương pháp định tính và định lượng Clenbuterol
Có 4 phương pháp thường được sử dụng để xác định clenbuterol:
1.2.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký bản phẳng được phát triển vào
đầu những năm 1950 và ứng dụng rộng rãi cho đến nay. Phương pháp này
đòi hỏi ít thiết bị, rẻ tiền. Tuy vậy khả năng phát hiện và độ nhạy còn hạn
chế nếu so với một số phương pháp phân tích hiện đại như sắc kí khí hay
sắc kí lỏng. Sắc kí lớp mỏng được sử dụng cho phân tích định tính và bán
định lượng CLB.
Một số nhà nghiên cứu thấy rằng sắc ký lớp mỏng tách tốt
clenbuterol với khả năng phát hiện cao theo quy trình sau:
Bản mỏng Silicagel 60 (Merck, 10x10cm). Dung môi pha động: ethyl
acetat: methanol: ammoniac (8,5:1:1) (hệ dung môi 1) và ethylacetate:
methanol: ammoniac (8,5:1:0,5) (hệ dung môi 2). Phun thuốc thử Ehrlich.
Rf (clenbuterol) 0,4 (hệ dung môi 1) và Rf (clenbuterol) 0,51 (hệ dung môi
2) [7], [17], [21]
1.2.2. Phân tích miễn dịch (ELISA)



14

pha động lỏng. Qúa trình tách theo cơ chế phân bố, hấp phụ hay trao đổi ion
tuỳ thuộc vào bản chất của chất cần phân tích và pha tĩnh sử dụng. Đặc
trưng của kỹ thuật là cột được nhồi với các tiểu phân có kích thước nhỏ
(thường từ 3 10 àm), quá trình rửa giải dung môi diễn ra dưới áp suất
cao và đạt được hiệu quả tách tốt hơn nhiều so với sắc ký lỏng thông
thường. Vì vậy kỹ thuật này được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng
hiệu năng cao [7], [19], [23], [28].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng phân tích rất tốt các chất doping
nhóm tăng đồng hoá trong đó có clenbuterol. Giới hạn phát hiện CLB bằng
phương pháp này rất cao nhất là khi ghép nối khối phổ. Daniel Zalko và các
cộng sự đã đưa ra điều kiện phân tích cho clenbuterol trong đối tượng mẫu
dịch chiết sinh học:
- Cột: Utra base C18 ( 250 x 4,6 mm, 5àm), cột bảo vệ: Hypersi BDS
C18 pre-guard column (18 x 4,6 mm, 5 àm).
- Dung môi: Amoni acetat 10 mM pH 3,2 /Acetonitril (95/5)- (Dung
môi A).
- Amoni acetat 10 mM pH 3,2/Axetonitril (30/70) Dung môi B
- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Gradient nồng độ: 0 4 phút, 100% A; 4 10 phút từ 100% A
đến 95% A (5% B); 10 30 phút, giữ 95%A (5% B); 30 35 phút từ 5%
B (96%A) đến 40 %B; 35 45 phút, 60% A và 40%B; 45 47 phút
100%B.
Detector: Khối phổ (MS Sim, Scan), giới hạn phát hiện là 0,3 àg/l
nước tiểu [22], [26].
Lehnert khi tiến hành phân tích clenbuterol từ huyết thanh ngựa cho
sử dụng CLB liên tiếp trong 10 ngày với lượng 0,8àg/kg (ngày). Sử dụng


dẫn nhiệt (TCD), ion hoá ngọn lửa (FID), cộng kết điện tử (ECD), nhưng
detector khối phổ có giá trị như một cuộc cách mạng trong phân tích lượng
vết do khả năng chứng minh trong định tính và giới hạn định lượng của nó.
Nguyên tắc chung:
Khi cho một chất ở trạng thái khí va chạm với 1 dòng electron thì
phân tử chất có thể bật ra 1 hay 2 electron để trở thành các ion dương mang
điện tích 1 hay 2, hoặc là phân tử chất có thể tiếp nhận electron để trở thành
ion âm, gọi là ion hoá phân tử. Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có
thể bị phá vỡ ra thành nhiều phần khác nhau mang điện tích dương hay âm.
Sự phá vỡ này hoàn toàn phụ thuộc vào năng lượng va chạm, dẫn đến các
cách phá vỡ phân tử khác nhau. Sau đó tách và đo khối lượng của tất cả các
ion này và ghi chúng trên một bản đồ phổ.
Thiết bị phân tích khối phổ bao gồm các bộ phận:
- Bộ nạp mẫu: Mẫu được dẫn vào một bình chứa ở đó áp suất có thể
giảm đến 10-6 mmHg sau đó dòng khí này được dẫn vào buồng ion hoá để
tạo ra các ion. Lượng mẫu có thể ghi nhận được rất nhỏ 10-13g/giây.
- Bộ nguồn ion: sử dụng các kỹ thuật sau để tạo ion:
+ Va chạm electron (Electron impact - EI).
+ Ion hoá hoá học (Chemical ionization - CI).


17

+ Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure
chemical ianization - APCI).
+ Ion hoá bằng nhiệt (Thermo spray ionization - ISI).
+ Ion hóa bằng giải hấp:
Giải hấp laser.
Bắn phá nhanh bằng nguyên tử.
Bắn phá nhanh bằng ion.


Trong đó:

m 2U
.
e H2

R :Bán kính lệch.
m: Khối lương ion
e: Điện tích ion
H: Cường độ từ trường.

Còn m/e ghi trên bản đồ phổ là số khối của các ion. Với thiết bị
GC/MS thì hỗn hợp khí mang và ion hoá của máy khối phổ để ion hoá mẫu
chất. Tuy nhiên tốc độ dòng khí ở cột sắc ký ra vào khoảng 0,2
2mL/phút (sắc ký mao quản), nên người ta phải giảm tốc độ dòng khí khi
đưa vào buồng ion là nhỏ hơn 0,2mL/phút, thế ion hoá của máy khoảng 20
eV nhỏ hơn thế ion hoá của He (24,582eV) do đó đảm bảo các phân tử khí
He không bị ion hoá, thế ion hoá 20 eV ít hơn 70 eV dẫn đến độ nhậy của
máy bị hạn chế, do vậy người ta phải tách khí He trước khi vào buồng ion
hoá [7], [12].
1.2.4.2. Phân tích định lượng.
Điều kiện phân tích. Để kết quả phân tích đúng đắn, điều cần thiết
trước hết là các cấu tử nghiên cứu phải được tách hoàn chỉnh mà không có
píc chồng lên nhau. Trước khi phân tích định lượng cần kiểm tra các điều
kiện sau đây:
- Độ lặp lại ( giữ nguyên các thông số)
- Mối tương quan giữa các các kết quả thu được trong trường hợp
thay đổi các thông số làm việc của thiết bị như cột tách, lượng mẫu bơm,
nhiệt độ.

E: khối lượng của mẫu
Mr: Khối lượng của chất nội chuẩn.
Ai: Diện tích của cấu tử i
Ar: Diện tích của cấu tử r.

Phương pháp tự nội chuẩn. Khi sắc đồ không còn chỗ hở cho việc
đưa thêm chất nội chuẩn vào, áp dụng phương pháp tự nội chuẩn tức là bằng
chính cấu tử cần xác định. Thêm vào hỗn hợp mẫu có khối lượng ban đầu là
E, một lượng mẫu cấu tử i đã biết là MIZ. Sau đó, so sánh píc của cấu tử i đó


20

giữa hai sắc đồ trước và sau khi cho thêm chất nội chuẩn (Ai1 và Ai2). Mặt
khác cũng so sánh sự thay đổi của một diện tích píc của cấu tử x khác (Ax1
và Ax2).
Hàm lượng phần trăm khối lượng cấu tử i cần xác định sẽ là:
Khối lượng % =

M iz .100
A x1 Ai 2

.E
Ax 2 Ai1

Trường hợp này không cần đến hệ số f và cũng không nhất thiết phải
có kỹ thuật bơm lặp lại [7], [12].
1.2.4.3. Dẫn xuất hoá các hợp chất trong phân tích lượng vết.
* Nguyên lý chung: Phương pháp sắc ký khí làm việc dựa vào việc
chuyển mẫu thành dạng hơi trong điều kiện thực nghiệm. Một số chất nhiều

Khi phân tích CLB bằng phương pháp GC/MS cần thiết phải dẫn xuất
hoá, các chất được dùng để dẫn xuất hoá như là: N, O- Bis (trimetylsilyl)
acetamit (BSA); sylon (BFT); trifluoroacetamid (BSTFA), trimetyl
clorosilan (TMCS) và N metyl-N (trimetylsilyl) trifluoro acetamid
(MSTFA).
Phản ứng dẫn xuất hoá xảy ra theo cơ chế thế, nhóm trimetyl silyl
thế nguyên tử hydro linh động của CLB tạo thành chất dẫn xuất CLB
TMS theo phương trình phản ứng sau:

H2N C6H2 Cl2- CHOH-CH2 NH-C(CH3)3
+ F3C CO N(CH3)-Si (CH3)3
H2N C6H2 Cl2- CHOSi(CH3)3 -CH2 NH-C(CH3)3
+ F3C-CO-NH-CH3


22

Hiệu suất phản ứng tạo thành CLB TMS phụ thuộc vào các điều
kiện phản ứng. CLB TMS được sử dụng để phân tích định tính và định
lượng CLB.[16], [30], [34]
1.3. Phương pháp chiết clenbuterol trong dịch sinh học
Chiết là quá trình tách chất từ một pha bằng cách cho pha này tiếp
xúc với pha thứ hai không trộn lẫn với pha thứ nhất, nếu hai pha đều là lỏng
ta có chiết lỏng lỏng, nếu một pha lỏng và một pha rắn ta có chiết lỏng
rắn [1].
1.3.1. Chiết lỏng lỏng
Nguyên tắc:
Chiết là sự tách chất dựa trên cơ sở sự hoà tan (hay phân bố) khác
nhau của chất trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau.
Chất X khi chiết được phân bố vào hai dung môi A, B không trộn lẫn

dung môi ethyl acetat : isopropanol (9:1), chất dẫn xuất là BSTFA, thiết bị
sử dụng phân tích là GC-MS giới hạn phân tích định tính đạt 4àg/kg [30].
1.3.2. Chiết pha rắn (SPE)
Chiết pha rắn là quá trình lưu giữ một chất từ hệ phức tạp bằng
một chất rắn được gọi là chất liên kết (sorbant), sau đó tách chất đó ra
khỏi chất liên kết bằng một dung môi hữu cơ - gọi là quá trình rửa giải.
SPE là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm
loại các chất ảnh hưởng của nền, hoặc làm giàu các chất cần phân tích
trước khi tiến hành các kỹ thuật phân tích [1], [15].
Thực ra kỹ thuật SPE đã được sử dụng từ lâu để tinh chế dịch
chiết trong chiết xuất lỏng- lỏng. Những công nghệ tiên tiến đã tạo ra
nhiều chất liên kết chọn lọc, hiệu quả nên trong vài thập kỷ qua kỹ
thuật chiết pha rắn ngày càng được ứng dụng rộng rãi. SPE không
những đóng vai trò độc lập như một kỹ thuật tách chiết mà còn được cài


24

đặt vào các hệ GC/MS, HPLC/MS tạo thành một hệ thống phân tích tự
động hoàn chỉnh [1], [7], [32].
1.3.2.1. Quá trình nghiên cứu SPE
Sự phát triển của kỹ thuật chiết pha rắn gắn liền với sắc ký lỏng
cổ điển. Từ năm 1906 nhà hoá học Nga Tsvet dùng cột nhồi calci
carbonat rắn hấp phụ các chất màu thực vật, sau đó dùng ether dầu hoả
rửa giải chất màu ra khỏi cột. Kỹ thuật tách này theo thuật ngữ hiện nay
gọi là tách pha thuận. Sau đó nhiều loại chất rắn được dùng thay thế cho
calci carbonat trong sắc ký pha thuận như oxyd silic, oxyd nhôm,
Florisil...
Năm 1941 Martin và Synge đã dùng một dung môi phân cực là
nước hấp phụ trên bề mặt silicagel làm pha tĩnh và dùng một dung môi

- Độ lặp lại của kỹ thuật chiết tương đối cao cho kết quả phân tích
tin cậy.
- Có thể tự động hoá toàn bộ quá trình chiết.
SPE đã được sử dụng rộng rãi trong thực hành phân tích, nó có thể
thay thế phần lớn kỹ thuật chiết lỏng - lỏng cổ điển. Chiết pha rắn có
thể được thực hiện phổ biến trên cột chiết, màng chiết ít sử dụng hơn,
ngoài ra còn sử dụng trên sợi chiết như vi chiết pha rắn (SPME) [1], [31].
1.3.2.2. Các loại pha rắn của SPE
Pha liên kết
Pha liên kết được tổng hợp từ hạt silicagel có kích thước 40- 60 à
m. Trên bề mặt của nó có liên kết hoá học với một pha lỏng. Không thể
dùng trực tiếp silicagel với hỗn hợp dung môi nước vì nước sẽ làm mất
hoạt tính của silicagel, làm cho tương tác rất yếu với các chất cần phân