BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM VĂN KIÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
MỘT SỐ TẠP CHẤT ALKALOID có MẶT TRONG
• • •
MẪU HEROIN BẰNG SẮC KÝ KHÍ
VÀ ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC 2001-2006)
Người hướng dẫn :GVCTRẦNTÍCH
THS. NGUYỄN XUÂN TRưìỉNG
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH
VIỆN KHOA HỌC HÌNH s ự
Thời gian thực hiện : 2-5/2006.
- -
Hà Nội, Tháng 5-2006
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, cùng với sự nỗ lực cố gắng
của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn
bè, và người thân.
Nhân dịp hoàn thành khóa luận, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến :
GVC. Trần Tích.
ThS. Nguyễn Xuân Trường.
Là những người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm đề
tài.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm 0fn các thầy cô, cán bộ, kỹ thuật viên Bộ
môn Hóa Phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội, lãnh đạo Trung tâm giám
định ma túy - Viện khoa học hình sự - Bộ Công an đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các phòng ban của trường Đại học Dược Hà Nội
đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 19
2.2. Kết quả thực nghiệm 20
2.2.1. Phương pháp sắc ký khí 20
2.2.2. Phương pháp điện di mao quản 32
2.3. Bàn luận kết quả 37
2.3.1. Phương pháp sắc ký khí 37
2.3.2. Phương pháp điện di mao quản 37
PHẦN 3: KẾT LUẬN 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHU LUC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
3-MAM
3-Mono Acetyl Morphin.
6 -MAM
6 -Mono Acetyl Morphin.
AC Acetylcodein.
CH
Capillary Electrophoresis.
CGE
Capillary Gel Electrophoresis
CIEF
Capillary Iso-Electric Focusing
c rip
Capillary Iso-Tacho-Phoresis.
CMC
Critical Micellary Concentration.
CZE
Capillary Zone Electrophoresis.
DAD Diode Array Detector.
DAM Diacety Imorphin.

tội phạm này tận gốc, cần phải có những thông tin xác thực để trả lời các câu
hỏi: ma tuý được sản xuất ở đâu, sản xuất như thế nào, đã dùng tiền chất nào,
được phân phối, vận chuyển như thế nào, ? Do vậy, truy nguyên nguồn gốc
heroin ở Việt Nam là một đòi hỏi thực tiễn và cấp bách trong công cuộc phòng
chống ma tuý .
Heroin là dạng bán tổng hợp từ morphin (qua một bước acetyl hóa),
morphin được tinh chế từ thuốc phiện. Thuốc phiện chứa nhiều alkaloid, trong
đó có các alkaloid chính là: Morphin, codein, noscapin, papaverin, thebain.
Mẫu heroin trên thị trường thường là hỗn hợp các thành phần, ngoài thành
phần chính là heroin còn có các alkaloid khác, đó là: Morphin, codein, 6 -
MAM, 3-MAM, acetylcodein, papaverin, noscapin Tùy theo nguồn gốc của
nguyên liệu (morphin thô) và phương pháp điều chế heroin khác nhau mà hàm
lượng các tạp này khác nhau [19]. Các mẫu heroin thu được ở Việt Nam
thường gồm có các tạp chất chính là: Morphin, acetylcodein, 6-MAM. Do vậy
việc định lượng đồng thời 4 alkaloid; Heroin (nguyên chất), morphin,
acetylcodein, 6 -MAM là một vấn đề quan trọng để truy nguyên nguồn gốc
Heroin.
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có phương pháp nào định lượng đồng thời 4
alkaloid trên.
Phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp điện di mao quản đã được ứng
dụng trong phân tích mẫu heroin ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, đem
lại kết quả định lượng tốt. [7], [10]
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành khóa luận tốt nghiệp:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số tạp chất alkaloid có
mặt trong mẫu heroin bằng sắc ký khí và điện di mao quản (CE)” nhằm
mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp và triển khai kỹ thuật sắc ký khí mao quản định
lượng đồng thời 4 alkaloid (heroin, morphin, acetylcodein, 6-MAM) trong
mẫu heroin.
- Bước đầu xây dựng phương pháp điện di mao quản vào việc xác định

narceine, nhưng trong phần lớn các trưòfng hợp thì nồng độ của nó thấp hofn
năm alkaloid kia. Ngoài ra trong thuốc phiện còn có acid meconic hàm lượng
thay đổi khác nhau tuỳ theo loại thuốc phiện. Trong quá trình bán tổng họfp
heroin từ morphin không tinh khiết thì sẽ tạo thành các tạp alkaloid trong mẫu
heroin. Trong đó:
- Acetyl hóa morphin tạo thành heroin, 3-MAM, 6 -MAM.
- Acetyl hóa codein tạo thành acetylcodein.
Trong mẫu heroin gặp ở Việt Nam, ngoài diacetyl morphin hay gặp các tạp
alkaloid là: Morphin, acetylcodein, 6 -MAM.
Dưới đây là một số tính chất vật lý của 4 alkaloid: Công thức hóa học,
công thức cấu tạo, nhiệt độ nóng chảy, độ hòa tan.
13.1.1. Heroin (dmmorphin, diacetylmorphin, acetomorphin). [8 ], [19]
Nhiệt độ nóng chảy (°C):
C H 3C 0 0
N-CH3
Công thức phân tử: C2JH23NO5.
Trọng lượng phân tử: 369.40.
Base HCl (IH2O)
173 243-244
Độ hòa tan Base HCl
Nước không tan dễ tan
Methanol tan dễ tan
Ethanol tan tan
Chloroform dễ tan dễ tan
Hằng số phân ly: pHg = 7,6
1.3.1.2. Morphin (morphium, morphia, duromorph, nepenthe, dolcotin) [8],
[19]
Nhiệt độ nóng chảy (°C):
Base HCICSHP)
247 - 249 200

Công thức phân tử: C20H23NO4.
Trọng lượng phân tử: 341.41
Base
HCKIHP)
133 345
Độ hòa tan Base HCl
Nước
rất khó tan tan
Methanol tan
tan
Ethanol tan tan
Chloroform
tan tan
1.1.2. Tình hình phân tích mẫu Heroin trên thê giới và ở Việt Nam.
Trên thế giới hiện nay có ba kĩ thuật được sử dụng để xác định các tạp chất
chính trong mẫu Heroin:
- Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao - HPLC [13], [14]: Từ những năm
1986, HPLC cột pha đảo được sử dụng để định lượng heroin và các tạp chất
alkaloid. Phương pháp này hạn chế khi phải phân tích các mẫu có nồng độ các
chất cách nhau quá xa, dẫn tới việc vượt qua giới hạn tuyến tính của detectơ.
Hơn nữa, về mặt kinh tế cần phải dùng nhiều dung môi có độ tinh khiết cao và
thời gian phân tích dài. Nếu giảm thời gian phân tích thì độ đúng và độ chính
xác của morphin bị hạn chế, do nó rửa giải quá sớm gần thời gian chết của cột.
Phương pháp này đã được ứng dụng tại Mỹ từ 1986, nhưng đến năm 2003
được thay thế bằng phương pháp Điện di mao quản.
- Kĩ thuật sắc ký khí - GC [6 ], [10], [11], [12], [15], [16], [17], [18]: Từ
năm 1982, phương pháp sắc ký khí được ứng dụng để phân tích các tạp chính
trong mẫu heroin. Năm 1992 phương pháp này được nghiên cứu trên mẫu dẫn
xuất hoá. Có hai loại pha tĩnh được sử dụng nhiều là 100% dimetyl siloxan và
5% diphenylmetylsiloxan. Nói chung, GC cho khoảng phát hiện rộng, hầu hết

- Thcd gian từ khi bơm mẫu đến điểm cực đại của pic được gọi là thời gian
lưu giữ toàn phần (thường gọi là thời gian lưu) Ir, nó bao gồm cả thcd gian chết
tợ (chúứi là thời gian lưu của một cấu tử trơ đối với pha tĩnh) và thời gian lưu
thật (còn được gọi là thòi gian lưu hiệu chỉnh)
t \ .
- to
- Thể tích lưu hiệu chỉnh
VN = VV-j = t’R.Fc.j
: Thể tích lưu.
j : Hệ số Martin.
Fc: Lưu lượng dòng hiệu chỉnh.
- Hằng số phân bố K:
K= ^ X ^ =kxp
no V l
n: Số mol của chất tan.
V : Thể tích toàn thể của pha tĩnh trong cột tách,
k : Hệ số dung lượng (k = — = — ), là đại lượng biểu diễn mối
no to
tương quan giữa thòi gian của chất tan lưu lại trong pha tĩnh trong pha động.
8
p :Tỷsốpha(VcA^L).
1.2.2.2. Năng suất cột tách.
- Năng suất tách của cột sắc ký được thể hiện qua số đĩa lý thuyết n:
n =
/ \2
IR
v ơ y
Ir : Thời gian lưu của chất tan.
ơ : Độ lệch chuẩn của pic sắc ký.
Trường hợp lý tưỏỉng, pic sắc ký có dạng hình Gauss.

Dq: Hệ số khuyếch tán phân tử trong pha khí.
Dp: Hệ số khuyếch tán phân tử trong pha lỏng.
kj : Hệ số dung lượng.
dị ; Độ dày của lớp phim pha tĩnh trên chất mang.
1.2.3. Phương thức làm việc của sắc ký khí.
1.2.2.1. Detector.
Có 5 loại Detector thường được kết nối để làm việc với thiết bị GC là:
- Detector dẫn nhiệt.
- Detector ion hóa ngọn lửa.
- Detector cộng kết điện tử.
- Detector Nitơ-Phospho.
- Detector quang kế ngọn lửa.
* Dựa trên cơ sở trang thiết bị của phòng thí nghiệm và yêu cầu của đề tài,
chúng tôi lựa chọn detector ion hóa ngọn lửa (FID): Nguyên tắc làm việc dựa
trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trường khi
có chất cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất
hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của
không khí để tạo thành các ion trái dấu tương ứng.
Các ion này được chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của
ngọn lửa (thế hiệu giữa hai bản điện cực này khoảng 205-300V).
Dòng ion đó được giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (10*-10*^n) và
độ giảm hiệu điện thế này được khuyếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số
lượng của ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu
tố sau:
- Cấu trúc hình học của detector.
- Tỷ lệ thành phần hydro/không khí.
10
- Nhiệt độ của ngọn lửa.
- Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định.
1.2.2.2. Khí mang.

lỏng trong ống mao quản. Dòng EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của chất
tan trong ống mao quản. Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan,
nghĩa là chất tan di chuyển trong dòng này. Trong Điện di mao quản người ta
thường phân cực mao quản sao cho dòng này hướng về catốt.
Lực điện trường E làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo
một hướng nhất định. Các chất khác nhau có điện tích và độ lớn khác nhau, sẽ
di chuyển theo các tốc độ khác nhau, do đó các chất phân tích được tách ra
khỏi nhau.
1.3.1.1. Các thành phần chính của thiết bị điện di mao quản. [3], [8]
- Mao quản: Là nơi xảy ra quá trình chia tách, thường được chế tạo từ Silica
nung chảy và được bao bề mặt trong bởi các thành phần khác trong các trường
hợp cụ thể, ngoài có phủ một lớp polyme, để làm cho ống mao quản mềm mại,
có thể uốn được và không bị gãy.
- Bộ phận tạo điện trưòfng có điện thế cao: Cường độ điện trường thường >
500V/cm, với trình độ kỹ thuật hiện nay có khả năng tạo điện trường tối đa là
30KV.
- Detector: Thường dùng loại detector ưv , DAD. Ngoài ra còn detector
huỳnh quang, điện hóa, khối phổ.
12
á
■
HP C apillary
Electrophoresis system
Hình 2: thiết bị điện di mao quản.
13.1.2. Các thông số phân tích của điện di mao quản:[3], [8]
* Thời gian điện di (tn,): Là thời gian để chất cần phân tích di chuyển từ
điểm đầu mao quản tới detector.
* Tốc độ điện di; Vgp (cm/s):
V ep =
Li

l^ep,2
: Độ lưu động điện di của chất thứ nhất.
: Độ lưu động điện di của chất thứ hai.
: Độ lưu động điện di trung bình của hai cấu tử.
13.1.4. Phân loại: [3], [5]
Phương pháp điện di mao quản được phân loại theo cơ chế tách, gồm các
loại:
- Điện di mao quản thường : CE.
- Điện di mao quản vùng : CZE.
- Điện di mao quản điện động học micelle ; MEKC.
- Điện di mao quản loại gel : CGE.
- Điện di mao quản hội tụ đẳng điện : CIEFL.
- Điện di mao quản đẳng tốc độ : CITP.
1.3.1.5. ưu, nhược điểm của phương pháp điện di mao quản.{?>], [5]
* í/ím điểm.
- Hiệu lực tách cao.
- Yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (vài nanogram).
- Tiêu tốn ít thuốc thử và dung môi, dung môi không độc và kinh tế hơn so
với dung môi của HPLC.
14
- Quá trình phân tích không phức tạp, có khả năng tự động hóa trong tách và
phân tích hàng loạt.
* Nhược điểm.
Do điện trở cao của mao quản, làm khó khăn dòng chảy nên thường dễ xuất
hiện hiệu ứng nhiệt Joule, vì vậy phải khống chế nhiệt độ của mao quản để
đảm bảo thu được kết quả tách ổn định.
1.3.2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản động học micelle (MEKC).
Dựa trên cơ sở thiết bị của phòng thí nghiệm và điều kiện phân tích của các
alkaloid trong mẫu heroin, chúng tôi chọn phương pháp MEKC.
1.2.2.1. Nguyên tắc của MEKC. [3], [5], [9]

ở Việt Nam, phương pháp MEKC mới được áp dụng trong một vài năm trở
lại đây, tại trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2003 mói bắt đầu triển khai kỹ
thuật này với đề tài “Định lượng các vitamin: Bj, B2, Bg, pp trong chế phẩm
thuốc tiêm Bencozym bằng phương pháp Điện di mao quản” Vì vậy, vấn đề
MEKC còn rất mới mẻ về học thuật, kinh nghiệm triển khai phương pháp
MEKC, cần được nghiên cứu tiếp.
1.2.23.Các yếu tố ảnh hưởng.{?>\ [5]
- Điện thế: Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu
ống mao quản. Tuy nhiên, nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng nhiệt
16
Joule tạo ra Gradient nhiệt trong ống mao quản, và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở
từng vùng trong ống mao quản, làm cho các phân tử ngay cả của một chất tan
cũng di chuyển không đồng nhất, dẫn đến sự khuyếch tán khác nhau và làm
mở rộng vùng mẫu.
- Nhiệt độ: Có ảnh hưỏíng đến độ nhót và độ dẫn điện của đệm, vì thế nó ảnh
hưởng tới tốc độ di chuyển. Trong một số trường hợp, nhiệt độ trong ống mao
quản tăng là nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của Protein, làm thay đổi thời
gian điện di và hiệu quả phân tích.
- Cột mao quản: Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính)
góp phần vào thời gian phân tích và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố
(chiều dài hiệu dụng và chiều dài cột mao quản) có thể làm giảm điện trường
và tăng thời gian phân tích.
- Dung dịch đệm:
+ Loại đệm và nồng độ đệm: Đệm thích hợp cho điện di mao quản là đệm
có dung lượng đệm lớn, độ dẫn điện tốt và giảm thấp nhất sự sinh dòng trong
đệm.
+ pH đệm: pH của đệm có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm
thay đổi dòng EOF. Tăng pH của đệm thường gây tăng dòng EOF.
- Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của một
số chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường làm

- Máy lắc Labinco.
- Autopipet 10-100, 100-1000 |Lil, màng lọc 0,2p,m.
- Các dụng cụ thủy tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức.
18
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.1.2.1. Phương pháp sắc ký khí.
* Khảo sát điều kiện phân tích.
-Xử lý mẫu.
- Điều kiện chạy máy.
* Xây dựng phương pháp định lượng hỗn hợp 4 alkaloid trong mẫu Heroin.
- Khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký khí: Tiến hành chạy sắc ký khí
nhiều lần khác nhau ở cùng một dung dịch chuẩn hỗn hợp, đánh giá độ ổn
định của hệ thống sắc ký khí.
- Khảo sát sự tuyến tính của diện tích đã được chuẩn hóa của diacetylmorphin,
morphin, acetylcodein, 6 -MAM vói nồng độ các chất tương ứng.
Pha một dãy dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn riêng lẻ (gọi là dung dịch
chuẩn gốc) và phối hợp các dung dịch chuẩn gốc với các lượng khác nhau để
thu được từng dung dịch hỗn hợp chuẩn ứng với từng điểm chuẩn định lượng.
Tiến hành chạy sắc ký khí, xác định thời gian luu và diện tích pic của từng
alkaloid và chất nội chuẩn. Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ các
alkaloid tương ứng với tỷ số diện tích pic của chúng vói diện tích của chất nội
chuẩn (R).
A a
A is
Aa : Diện tích pic của alkaloid.
Ajs : Diện tích pic của nội chuẩn.
- Khảo sát tính chính xác của phương pháp;
Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phưoíng pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Thêm chính xác một lượng từng chất chuẩn (diacetylmorphin, morphin,

mang đã đáp ứng được yêu cầu phân tích.
20
- Nhiệt độ:
+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu:
Do các alkaloid này có nhiệt độ bay hoi cao, nên khảo sát nhiệt độ trong
buồng bơm mẫu tại các nhiệt độ: 250, 260, 270, 280, 290°c. Cuối cùng nhiệt
độ trong buồng bơm mẫu tối ưu được lựa chọn là 270°c.
+ Nhiệt độ lò:
Acetylcodein và 6 -MAM là hai chất khó tách ra khỏi nhau đối với sắc ký khí.
Dùng chương trình đẳng nhiệt thì hai chất này không tách ra khỏi nhau được.
Do đó, chọn chương trình nhiệt độ, thì hai chất này tách tốt ra khỏi nhau.
Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ ban đầu 200°c, tăng 10°c/phút đến 280°c,
giữ đẳng nhiệt 3 phút.
+ Nhiệt độ của Detector: Nhiệt độ của Detector thường được chọn lớn hơn
hoặc bằng nhiệt độ cuối của cột, do đó chọn nhiệt độ của Detector là 280°c.
- Điều kiện bơm mẫu:
Bơm mẫu theo phương pháp không chia dòng, do phương pháp này tránh
được hiện tượng “phân biệt đối xử”.
Qua khảo sát thấy ở tốc độ khí mang 1,3 ml/phút thì hai chất khó tách ra
khỏi nhau nhất là Acetylcodein và MAM-6 đã tách tốt ra khỏi nhau (ứng với
nồng độ mỗi chất 0,5mg/ml thì Rs = 1,3)-
Thể tích tiêm mẫu: 1,0 1^1.
- Chất nội chuẩn: Chọn chất nội chuẩn là heneicosan (C21H44), chất này đảm
bảo được các tiêu chuẩn của chất nội chuẩn.
Qua khảo sát các điều kiện như trên, chúng tôi đưa ra điều kiện chuẩn chạy
sắc ký khí như sau:
- Dung môi pha mẫu: hỗn hợp MeOH/Ethylacetat (1/1).
- Cột mao quản: J&W 122-5032 DB-5.
- Detector; FID, t° = 280°c. Khí đốt; Hydro (40ml/phút) và không khí
(400ml/phút) Khí bổ trợ; Nitơ (30ml/phút).