BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ
NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH

HỌ VÀ TÊN
( Tác giả luận văn)

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÂN
TÍCH
HỌ VÀ TÊN
( Tác giả luận văn)

2



ĐẶNG THANH HUYỀN----------&----------

TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG
AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍKÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH
GOUT Ở NGƯỜI

Chuyên ngành

:

Hoá phân tích

Mã số

:
60.44.01.18

CHUYÊN NGÀNH

:

Hoá học

Phân tích
MÃ SỐ:

60440118


DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT.......................................................................33
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ..............................................................................................34
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU........................................................................................36
MỞ ĐẦU................................................................................................................................2

2. Mục đích nghiên cứu...............................................................................3
5. Kết quả đạt được......................................................................................4
Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình
phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit
uric trong mẫu nước tiểu của người. (Phần này sẽ viết lại sau khi kết
thúc các thí nghiệm).....................................................................................5
6. Những điểm mới của đề tài.....................................................................5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN...................................................................................................6

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC.............................................6
1.1.1. Thông tin chung.................................................................................6
1.1.2. Tính chất vật lý..................................................................................6
1.1.3. Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric...7
1.1.4. Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ
thể..................................................................................................................8
1.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp...................9
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric11
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO.............................................................................................................12


1.2.1.1. Khái niệm về sắc ký......................................................................12
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC...............................................13
1.2.2.1. Hệ thống bơm................................................................................13
1.2.2.2. Hệ bơm mẫu..................................................................................14

1.4.2.1. Nguyên tắc của phương pháp......................................................29
1.4.2.2. Điện cực làm việc..........................................................................30
1.4.2.3. Ưu điểm của điện cực giọt Hg......................................................31
1.4.2.4. Điện cực so sánh............................................................................31
1.4.2.5. Sóng cực phổ khuếch tán..............................................................32
1.5. YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM
NGHIỆM DƯỢC PHẨM [1]....................................................................35
1.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp.....................................................35
1.5.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính...............................................36
1.5.3. Độ đúng.............................................................................................37
1.5.4. Độ chính xác.....................................................................................37
1.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng....................................37


1.5.5.1. Giới hạn phát hiện ( LOD)...........................................................37
1.5.5.2. Giới hạn định lượng ( LOQ)........................................................39
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM...........................................................................................41

2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ....................................................................41
2.1.1. Hóa chất............................................................................................41
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị...........................................................................41
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................41
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................42
2.3.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký................................................43
2.3.1.1. Lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại..........................................43
2.3.1.4. Khảo sát hệ đệm............................................................................44
2.3.1.5. Khảo sát pH hệ đệm......................................................................44
picpicpic2.3.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm.................................45
2.3.1.3. Lựa chọn bước sóng......................................................................45
2.3.1.74. Khảo sátLựa chọn thời gian lưu của chất.................................45

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................55

3.1. Xây dựng điều kiện để định tính axit uric........................................55
3.1.1. Lựa chọn phương pháp sắc ký........................................................55


3.1.1.1. Chọn bước sóng hấp thụ cực đại.................................................55
3.1.1.2. Khảo sát thành phần pha động....................................................56
3.1.1.3. Khảo sát tốc độ dòng....................................................................57
3.1.1.4. Khảo sát hệ đệm............................................................................58
3.1.1.5. Khảo sát pH hệ đệm......................................................................59
3.1.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm................................................61
3.1.1.7. Khảo sát thời gian lưu..................................................................63
.....................................................................................................................64
3.1.2. Đánh giá tính thích hợp của phương pháp và kiểm tra đường
chuẩn...........................................................................................................65
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric............................................65
3.1.2.3. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký..............................69
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký..............................70
3.1.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp...........................................71
3.2.2. Các kết quả đo mẫu nước tiểu........................................................73
K...........................................................................................................................................84
iệnpic,picpic,picpicpicpic.....................................................................................................84
..............................................................................................................................................84
2.7.2.1. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu..........................84
Xây dựng đường chuẩn Spic = f(C) theo phương pháp hồi quy tuyến tính, từ đó chọn được
khoảng nồng độ tối ưu mà tại đó diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của mỗi
chất.......................................................................................................................................85
Tìm đường chuẩn dạng: y=ax+b (2.2)..................................................................................85


..............................................................................................................................................86
(2.13)....................................................................................................................................86
Giả thuyết thống kê..............................................................................................................87
H0: X ≠ µX do ngẫu nhiên...................................................................................................87
Ha: X ≠ µX không do ngẫu nhiên với độ tin cậy 95%.........................................................87
(2.14)...................................................................................................................................87
So sánh t với tb (0,05; m-1)..................................................................................................87
- Nếu t > tb chấp nhận Ha, X ≠µX đường chuẩn vừa tìm được không phù hợp với độ tin
cậy 95%................................................................................................................................87
- Nếu t < tb chấp nhận H0, X ≠µX chỉ do ngẫu nhiên, đường chuẩn vừa tìm được là phù
hợp........................................................................................................................................87
2.7.2.2. Kiểm tra đường chuẩn.............................................................................................87
Thực nghiệm:.......................................................................................................................87
- Pha mỗi chất hai dung dịch có nồng độ xác định µX1 , µX2 từ các dung dịch chuẩn ban
đầu........................................................................................................................................87
- Hút 10µl sau đó bơm vào sắc ký và chạy sắc ký với điều kiện sắc ký đó chọn ở trên. Mỗi
chất làm lặp lại 7 lần (m=7) cho mỗi nồng độ.....................................................................87
- Sử dụng đường chuẩn tính X1 và X2, so sánh với hai giá trị đã pha µX1, µX2...............87
- Tính giới hạn phát hiện của phương pháp, so sánh với thực nghiệm................................87
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................88
Trong luận văn này, tôi tập trung nghiên cứu điều kiện tối ưu phân tích axit uric trên cơ sở
thiết bị, máy móc, hóa chất, môi trường thí nghiệm ở Việt Nam. Mục đích là dựa trên các
điều kiện này xác định được định tính và định lượng axit uric có trong nước tiểu một cách
nhanh chóng, hiệu quả và chính xác.....................................................................................88


3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric......................................................................88
3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký.....................................................................................88
Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của axit uric, kết hợp với các điều kiện tài liệu tham khảo
và điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm, tôi lựa chọn kiểu sắc ký phân bố pha đảo, sử

methanol và nước cất. Do đó, thành phần pha động được nghiên cứu khảo sát là phần trăm
thể tích của 3 loại dung môi trên..........................................................................................90
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thành phần pha động tới chiều cao và diện tích píc của axit uric
..............................................................................................................................................90
Thành phần pha động...........................................................................................................90
Tỉ lệ pha động (%V).............................................................................................................90
Spíc(mAU)...........................................................................................................................90
Metanol.................................................................................................................................90
Nước cất...............................................................................................................................90
Acetronitril...........................................................................................................................90
Hỗn hợp 1.............................................................................................................................90
50..........................................................................................................................................90
35..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
2938999................................................................................................................................90
Hỗn hợp 2.............................................................................................................................90
60..........................................................................................................................................90
30..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
3484525................................................................................................................................90
Hỗn hợp 3.............................................................................................................................90
65..........................................................................................................................................90


25..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
3353691................................................................................................................................90
Hỗn hợp 4.............................................................................................................................90
70..........................................................................................................................................90
20..........................................................................................................................................90

-.............................................................................................................................................92
0,35.......................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
6.392.....................................................................................................................................92
3227102................................................................................................................................92
0,5.........................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
3,936.....................................................................................................................................92
5179608................................................................................................................................92
0,75.......................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
2,634.....................................................................................................................................92
3234832................................................................................................................................92
1............................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
Không xuất hiện píc.............................................................................................................92
-.............................................................................................................................................92


1,5.........................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
Không xuất hiện píc.............................................................................................................92
-.............................................................................................................................................92
3.1.1.4. Khảo sát hệ đệm......................................................................................................93
Hệ đệm cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích hàm lượng axit
uric bằng phương pháp HPLC. Trong nghiên cứu này, một số dung dịch đệm được dùng để
khảo sát. Kết quả khảo sát được đưa ra trong bảng 3.3........................................................93
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến thời gian lưu, diện tích píc của axit uric.....93
Giá trị pH..............................................................................................................................93
tR (phút)...............................................................................................................................93

đệm photphat pH = 6 cho diện tích píc (5076680mAU) cao hơn so với khi dùng đệm
amoni, đệm axetat và nước cất.............................................................................................94
Bên cạnh đó, trong trường hợp sử dụng dung dịch đệm amoni thì thời gian lưu tương ứng
là 7,534 phút còn đối với đệm photphat là 3,936 phút. Thời gian lưu quá dài dẫn tới tốn
kém về mặt dung môi và thời gian phân tích. Thông thường, thời gian lưu tốt nhất cho một
mẫu chất nên xuất hiện ở phút từ 1 đến 5.............................................................................94
Từ những phân tích trên, trong nghiên cứu này, dung dịch đệm phophat được lựa chọn sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.......................................................................................94
3.1.1.5. Khảo sát pH đệm.....................................................................................................94
Việc lựa chọn được môi trường cho kết quả định lượng là tối ưu nhất đặt ra vấn đề phải
khảo sát để tìm ra giá trị pH đáp ứng yêu cầu đó. Trên cơ sở chọn được hệ đệm photphat ta
tiến hành chuẩn bị các dung dịch đệm photphat có lần lượt các giá trị pH tương ứng là 2, 4,
6, 8, 9, 10. Để so sánh tính hiệu quả của phép phân tích định lượng axit uric trong các môi
trường pH này thì tiến hành cân cùng một lượng mẫu axit uric như nhau pha trong cùng


một thể tích xác định các dung dịch đệm đã chuẩn bị. Tiến hành đo trong cùng một điều
kiện đo và ghi lại thời gian lưu, diện tích píc. Từ đó so sánh, nhận xét khả năng của mỗi
môi trường pH trên đối với sự định lượng axit uric.............................................................95
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat đến thời gian lưu, diện tích píc
của axit uric..........................................................................................................................95
Giá trị pH..............................................................................................................................95
tpíc (phút)............................................................................................................................95
Spíc(mAU)...........................................................................................................................95
2,0.........................................................................................................................................95
3,936.....................................................................................................................................95
1921030................................................................................................................................95
4,0.........................................................................................................................................95
3,936.....................................................................................................................................95
1700990................................................................................................................................95

3.826.....................................................................................................................................96
3170130................................................................................................................................96
7,7.........................................................................................................................................96
3,936.....................................................................................................................................96
3353748................................................................................................................................96
8,0.........................................................................................................................................96
3,936.....................................................................................................................................96
4354859................................................................................................................................96
8,4.........................................................................................................................................96


3.973.....................................................................................................................................96
3672993................................................................................................................................96
8,7.........................................................................................................................................96
3.935.....................................................................................................................................96
3378834................................................................................................................................96
Từ bảng 3.5 ta thấy trong cùng một lượng chất và điều kiện như nhau, tại pH = 8 diện tích
đạt giá trị cao nhất (4354859 mAU). Do vậy, trong nghiên cứu này tôi lựa chọn dung dịch
đệm photphat có pH = 8 để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo....................................97
..............................................................................................................................................97
Hình 3.3. Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat có pH=8..............................97
3.1.1.6. Khảo sát nồng độ đệm.............................................................................................97
Cùng với pH của dung dịch đệm chất điện ly trong pha động cũng có vai trò quan trọng và
nó phải có nồng độ phù hợp. Việc lựa chọn nồng độ dung dịch đệm dựa trên tài liệu tham
khảo, các nồng độ dung dịch đệm được lựa chọn khảo sát trong khoảng 2.10-3M – 0,2M.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.6...................................................................97
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm photphat đến thời gian lưu, diện tích píc
của axit uric..........................................................................................................................97
Nồng độ đệm(M)..................................................................................................................98
tpíc (phút).............................................................................................................................98

trong các thí nghiệm tiếp theo của luận văn này..................................................................99
..............................................................................................................................................99
Hình 3.4. Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat nồng độ 0,01M....................99
Từ các kết quả khảo sát, em đã xây dựng một quy trình sắc ký có khả năng phân tích xác
định nồng độ axit uric như sau:............................................................................................99


- Pha tĩnh: Cột ODS C18 (5µm, 4,6 x 150 cm)....................................................................99
- Pha động: 60% methanol – 30% nước cất – 10% acetronitril; dung dịch đệm KH2PO4 +
KOH có pH = 8,0 (nồng độ đệm 0,01M).............................................................................99
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút...................................................................................................99
- Thời gian chạy mẫu: 10 phút.............................................................................................99
- Thể tích mẫu phân tích tối thiểu cần bơm vào cột sắc ký: 10 µl.....................................100
- Phát hiện bằng detector UV: bước sóng 284 nm.............................................................100
- Nhiệt độ phân tích: 40°C..................................................................................................100
Qua thực nghiệm với điều kiện sắc ký như trên, axit uric xuất hiện ở thời gian lưu vừa
phải, píc cân đối và gọn......................................................................................................100
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng...........................................................................100
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric.......................................................................100
Cân chính xác 5mg chất chuẩn axit uric, sau đó thêm đệm photphat (pH=8) vào bình định
mức 100ml và lắc sau đó định mức đến vạch định mức thu được dung dịch axit uric chuẩn
có nồng độ chính xác..........................................................................................................100
3.1.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.........................................................100
Để đánh giá một phép định lượng bằng HPLC mới xây dựng, trước hết ta phải tiến hành
khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.......................................................................100
Việc khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được tiến hành qua việc tiêm lặp lại 6 lần
dung dịch chuẩn axit uric đã được chuẩn bị như 3.1.2.1. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu
(đại lượng có giá trị định tính axit uric), diện tích píc (đại lượng có giá trị định lượng axit
uric), độ phân giải giữa hai píc. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên các
giá trị độ lệch chuẩn tương đối về tR, Spíc, RS. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ