Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO

Bộ Y Tế

tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI

Nguyễn Trung Nghĩa

nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích
định lượng clorpromazin
trong huyết tương người

Luận văn Thạc sĩ Dược học
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất
Mã số : 60.73.15

Hà nội - 2006


Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO

Bộ Y Tế

tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI

Nguyễn Trung Nghĩa

nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích
định lượng clorpromazin
trong huyết tương người
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất


Nguyễn Trung Nghĩa


-I-

BẢNG CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBZ
CPZ
HPLC

:
:
:

HT
LOQ
MS
PĐ
PA
RSD
SD
S/N
TƯ
t 1/2
t max
UV
VN


Trung Ương
thời gian bán hủy
thời gian đạt nồng độ thuốc cực đại
Tử ngoại (Ultra Violet)
Việt Nam


-II-

MC LC
Trang

T VN

1

Chng 1: TNG QUAN

2

1.1 Clorpromazin

2

1.1.1. Công thức

2

1.1.2. Tính chất


1.4. Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin

Chng 2: I TNG - PHNG PHP NGHIấN CU

19
22

2.1. Đối tượng nghiên cứu

22

2.2. Hoá chất - trang thiết bị

22

2.2.1. Hoá chất

22

2.2.2. Thiết bị - dụng cụ

23

2.3. Phương pháp nghiên cứu

23

2.3.1. Xây dựng quy trình định lượng

23


34

3.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng

38

3.2.1. Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

38

3.2.2. Tính chọn lọc

40

3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

43

3.2.4. Giới hạn định lượng dưới

48

3.2.5. Độ đúng - độ chính xác - độ tìm lại

49

3.2.6. Độ ổn định

53


DANH MC CC BNG TRONG LUN VN


-IV-

Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin..................

19

3.2

Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký...........................

32

3.3

Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ CPZ trong huyết tương

44


3.9

Kết quả khảo sát độ ổn định của CPZ trong thời gian phân tích......

53

3.10

Kết quả khảo sát độ ổn định của CPZ trong thời gian bảo quản.....

54

3.11

Kết quả đ ịnh lượng thăm dò CPZ trong huyết tương bệnh nhân....

55


-V-

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình

Nội dung

Trang

1.1


Kết quả khảo sát cột sắc ký và hệ pha động cho định lượng CPZ/HT....

36

3.7

Phổ hấp thụ UV của CPZ trong hệ pha động....................................

37

3.8

Sắc đồ khảo sát sự phù hợp của hệ thống sắc ký...............................

39

3.9

Các sắc ký đồ thể hiện tính chọn lọc của phương pháp.....................

42

3.10

So phổ UV của pic có R t = 4,820 phút với phổ của CPZ chuẩn........

43

3.11

nồng độ 2g/mL có thể gây tử vong. Một nghiên cứu trên 8 ca tử vong cho
thấy nồng độ clorpromazin trong máu toàn phần dao động từ 3 - 35g/mL
(trung bình 17g/mL) [18], [28].
Với mục đích góp phần vào việc xác định nồng độ của thuốc
clorpromazin trong máu phục vụ cho việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu
các bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện, chúng tôi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng
clorpromazin trong huyết tương người"
Để thực hiện mục đích trên, đề tài nghiên cứu gồm các nội dung sau:
- Khảo sát quy trình chiết clorpromazin trong huyết tương người và xây
dựng chương trình HPLC để định lượng clorpromazin.
- Thẩm định chương trình đã xây dựng và áp dụng định lượng
clorpromazin trong huyết tương bệnh nhân.
-


2

Chương 1: Tổng quan
1.1 Clorpromazin
1.1.1 Công thức
- Clorpromazin
CH3
N

CH3

N

Cl


R

R

R

R

R

R

R

R

Trong thực tế thường gặp thuốc dưới dạng hydroclorid.
- Clorpromazin hydroclorid
C 17 H 19 ClN 2 S.HCl
R

R

R

R

R


1950 - 1980C.
P

P

P

P

+ Rất dễ tan trong nước, dễ tan trong ethanol và thực tế không tan trong ether,
benzen.
+ Hằng số phân ly:

pK a = 9,3 (200C)

+ Hệ số phân bố:

LogP (octanol/nước pH 7,4) = 3,4

+ Hấp thụ UV:

max = 254nm và 306nm [4], [7], [11], [12], [17]

R

R

R

P

Nồng độ clorpromazin huyết tương đạt đỉnh sau 2-4 giờ sau uống với liều
điều trị. Nồng độ đỉnh này kéo dài khoảng 3-4 giờ nữa và sau đó giảm dần
+ Phân bố: clorpromazin được phân bố rộng trong hầu hết các mô và
dịch của cơ thể, thuốc có thể qua hàng rào máu não và nồng độ trong não cao
hơn nồng độ trong huyết tương. Clorpromazin liên kết protein huyết tương
khoảng 95 - 98%, chủ yếu là liên kết albumin, có tài liệu cho rằng nó kết hợp
với albumin huyết tương tới 99%. Bình thường với liều điều trị, nồng độ
clorpromazin huyết tương từ khoảng 0,03 - 0,3àg/mL. Clorpromazin và các
sản phẩm chuyển hóa của nó có thể qua nhau thai và vào được sữa mẹ.
+ Chuyển hóa và thải trừ: clorpromazin được chuyển hóa chủ yếu tại
gan bởi các quá trình hydroxyl hóa và liên hợp glucuronic, N - oxy hóa, oxy
hóa nguyên tử sulfur và khử alkyl hóa, khử methyl hóa. Có hơn 15 chất
chuyển hóa của clorpromazin đã được xác định, nửa số đó thải trừ qua nước
tiểu và phân. Vài sản phẩm có hoạt tính như 7- hydroxyclorpromazin, còn sản
phẩm khác như clorpromazin sulfoxid thì bất hoạt. Bệnh nhân đáp ứng thuốc
có nồng độ cao các chất chuyển hóa có hoạt tính nhưng sulfoxid thì thấp. Có
hai nhóm sản phẩm chuyển hóa chính của clorpromazin được phát hiện trong
nước tiểu. Nhóm thứ nhất là các sản phẩn không liên hợp, gồm
demonomethylclorpromazin, dedimethylclorpromazin, các sản phẩm chuyển
hóa dạng sulfoxid, clorpromazin N-oxid và clorpromazin nguyên dạng, chiếm
khoảng 20%. Nhóm thứ hai là các sản phẩm liên hợp, chiếm khoảng 80%,
gồm chủ yếu các O-glucuronid và một số ít các ether sulfat của các dẫn chất
mono và dihydroxy của clorpromazin và các chất chuyển hóa sulfoxid của nó.
Hai chất chuyển hóa chủ yếu được tìm thấy trong nước tiểu là
monoglucuronid của N- dedimethylclorpromazin và 7- hydroxyclorpromazin.


5

Các sản phẩm chuyển hóa của phenothiazin thường là thân dầu, có thể tích

R

R

+ Trên hệ tiết serotonin (5HT) trung ương
Có tới 15 loại receptor 5HT, nhưng với bệnh tâm thần thì receptor
5HT 2 (đặc biệt là 5HT 2A ) có vai trò quan trọng hơn cả. Trong não, nhân tổng
R

R

R

R

hợp 5HT nhiều nhất (có thể là duy nhất) là các nhân Raphe (Raphe nuclei).
Các nhân này kiểm soát sự tổng hợp DA ở cả thân tế bào và sự giải phóng DA
ở trước synap của các nơron hệ DA. Nhìn chung, 5HT ức chế giải phóng DA.
Giả thuyết sinh hóa về bệnh tâm thần phân liệt cho rằng, các triệu chứng
dương tính là do tăng hoạt hệ DA ở hệ viền và mất cơ chế điều hòa ngược
trung ương, còn các triệu chứng âm tính là do rối loạn chức phận vùng trán
trước, làm giảm hoạt hệ DA não giữa - vỏ não do tăng hoạt hệ 5HT 2 .
R

R

Clorpromazin ức chế D 2 mạnh hơn 5HT nhiều nên tác dụng trên triệu chứng
R

R

adrenergic ngoại biên. Tác dụng hủy phó giao cảm thể hiện bằng nhìn mờ (do
giãn đồng tử), táo bón, giảm tiết dịch vị, giảm tiết nước bọt, mồ hôi. Tác dụng
hủy 1 adrenergic tương đối có ý nghĩa, có thể phong tỏa tác dụng tăng áp của
R

R

noradrenalin.
+ Trên hệ nội tiết


7

Làm tăng tiết prolactin, gây chảy sữa và chứng vú to ở đàn ông.
Làm giảm tiết FSH và LH, có thể gây ức chế phóng noãn và mất kinh.
+ Có tác dụng kháng histamin H 1 nhưng yếu [3], [6], [19].
R

R

- Tác dụng không mong muốn
+ Loại thường gặp, liên quan đến tác dụng dược lý
Rối loạn tâm lý: chóng mệt mỏi, suy nghĩ chậm chạp, trạng thái trầm cảm,
lú lẫn (nhất là người có tuổi).
Tụt huyết áp thế đứng và nhịp tim nhanh, nhất là khi tiêm.
Khô miệng, nuốt khó, bí đái, rối loạn điều tiết thị lực, cơn tăng nhãn áp cấp,
táo bón... là những dấu hiệu hủy phó giao cảm.
Rối loạn điều tiết và sinh dục: ức chế phóng noãn, vô kinh, chảy sữa, giảm
tình dục, tăng cân.
Hội chứng ngoại tháp: thay đổi tùy thuộc vào thời gian điều trị, vào liều

+ Viên nang tác dụng kéo dài 30, 75, 150, 200 và 300mg.
+ Sirô 2mg/mL, 5mg/mL, 20mg/mL.
+ Thuốc đạn 25, 50 và 100 mg.
+ Thuốc uống dạng giọt 4%.
+ ống tiêm 25mg/2mL và 50mg/5mL [6], [7], [12], [17], [36].
Một số biệt dược:
+ Aminazin (Nga)
+ Amplictil (Rhodia, Brasil)
+ Chloractil (DDSA, Anh)


9

+ Largactil (Pháp; Italia)
+ Plegomazine (Egis, Hungary)
+ Procalm (Bramble, Australia)
+ Promexin (Meiji, Nhật)
+ Promosol (Horner, Canada)
+ Prozil (Dumex, Đan Mạch)
+ Thorazine (Smith Kline & French)
1.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Chiết xuất là quá trình tách chất từ một pha bằng cách cho pha này tiếp
xúc với pha thứ hai không trộn lẫn với pha thứ nhất, nếu hai pha đều là lỏng ta
có chiết lỏng - lỏng (liquid - liquid extraction: LLE), nếu một pha lỏng và
một pha rắn ta có chiết lỏng - rắn (liquid - solid extraction: LSE). [1], [5]
Chiết lỏng - lỏng được sử dụng rộng rãi, các ưu điểm cũng như nhược
điểm của phương pháp này đã được biết rõ.
Ưu điểm là giá thành thấp, dịch chiết phù hợp với hệ thống sắc ký và có
thể dễ dàng thay đổi dung môi để có độ chọn lọc cao. Tuy nhiên, kỹ thuật này
cũng có một số nhược điểm liên quan đến việc sử dụng dung môi, như phải sử

+ Chiết gián đoạn
+ Chiết liên tục
+ Chiết ngược dòng [1], [5], [15], [28], [37].
1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography:
HPLC)
Lịch sử của sắc ký: năm 1903, Tswett - nhà hóa sinh người Nga đã phát
triển một kỹ thuật tách mới bằng cách cho hỗn hợp cần tách qua một cột được
nhồi với chất hấp phụ dạng bột mịn. Hỗn hợp được đưa lên đỉnh cột, sau đó
rửa cột với dung môi hữu cơ. Cùng với quá trình rửa, các thành phần của hỗn
hợp trôi xuống với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Hầu hết các mẫu
của Tswett là chất màu thực vật, do đó các dải màu tạo thành khi các hợp chất


11

tách ra trên cột được nhìn thấy dễ dàng, trông giống như một sắc đồ và vì vậy
phương pháp này được mang tên sắc ký (Chromatography, trong tiếng Hy
Lạp, chroma là màu, graphein là viết). Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng
mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu. Tswett
giải thích sự tách là do các phân tử chất rửa giải được hấp phụ trên bề mặt của
bột nhồi trong cột, các chất này có ái lực mạnh với chất rắn và không dễ bị
giải hấp phụ bởi dung môi do đó các hợp chất di chuyển chậm trong cột. Các
chất hấp phụ yếu hơn di chuyển với tốc độ lớn hơn, do đó sự tách đạt được do
ái lực khác nhau giữa chất rửa giải với dung môi và chất rắn hấp phụ.
Công trình của Tswett là dạng sắc ký hấp phụ trên cột. Ngày nay, nhiều
phương pháp sắc ký đã được phát triển và hoàn thiện như sắc ký lớp mỏng, sắc
ký giấy, sắc ký khí, sắc ký lỏng; nhưng chúng đều dựa trên nguyên tắc đơn
giản là: sự tách đạt được là do tốc độ di chuyển khác nhau gây nên bởi ái lực
tương đối khác nhau giữa hai pha. Năm 1952, máy sắc ký khí đầu tiên được
ra đời dưới sự chủ trì của giáo sư Keulemann và các cộng tác viên, bài báo đầu

ion hoặc loại theo cỡ.
* Sắc ký phân bố
- Sắc ký phân bố lỏng - lỏng (liquid - liquid partitioning): pha tĩnh cũng
là chất lỏng và được bao trên bề mặt của các hạt chất mang (support) tức là
được hấp phụ trên chất mang. Trong sắc ký này, pha tĩnh thường bị dung môi
hòa tan và mất dần (hiện tượng "chảy máu cột") và làm cột mất dần hiệu lực.
Phương pháp này hiện nay ít được sử dụng.
- Sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography: BPC): pha tĩnh
được sử dụng là các hạt silicagel có đường kính 3 -10àm, các hạt phải đồng
đều, có dạng hình cầu và phải xốp, bề mặt của hạt có các nhóm silanol và các
tạp kim loại. Silicagel có thể được sử dụng trực tiếp để tách sắc ký, trong
trường hợp này cơ chế tách chủ yếu là hấp phụ kết hợp với liên kết phân cực,


13

ta có sắc ký pha thuận. Sử dụng phổ biến hơn là gắn hóa học silicagel với một
alkylsilan tạo nên hợp chất cơ siloxan. Nếu gốc gắn vào có tính phân cực tạo
nên pha tĩnh có tính phân cực thì sử dụng pha động là các dung môi ít phân
cực ta có sắc ký pha thuận (normal phase); ngược lại, nếu gốc gắn vào là ít
phân cực ta thu được pha tĩnh kỵ nước và khi sử dụng pha động là dung môi
phân cực ta có sắc ký pha đảo (reversed phase). Trong thực tế, thường gặp sắc
ký pha đảo vì một số ưu điểm như: tính linh động cao, độ chọn lọc cao; cân
bằng phân bố xảy ra nhanh, có thể sử dụng các cân bằng phụ để tăng cường độ
chọn lọc của phương pháp; hiệu quả tách cao, pic cân đối; pha động thường là
hỗn hợp của nước và các dung môi phân cực nên rẻ tiền. Tuy nhiên phương
pháp cũng còn một số nhược điểm như: độ lặp lại kém, hoạt động của pha tĩnh
có hiệu quả trong khoảng pH hẹp (pH: 2 - 8) và cơ chế tách phức tạp.
* Sắc ký hấp phụ: là phương pháp được phát triển sớm nhất và dùng phổ
biến. Trong phương pháp này, chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp

1 hỗn hợp base mạnh và yếu. Thường đa chức, có 2 giá trị hấp dung.
+ Ionid loại 4: thể hiện tính chất như một hỗn hợp nhiều acid yếu có K a
R

R

khác nhau hoặc một hỗn hợp base yếu có K b khác nhau, vì vậy hấp dung của
R

R

ionid thay đổi dần.
Các ionid không tan trong nước, khi tiếp xúc với dung dịch hỗn hợp ion
thì xảy ra sự trao đổi, sau đó dùng dung dịch acid hoặc base làm dung dịch rửa
giải thì sẽ phản hấp phụ các ion và xảy ra quá trình hồi nguyên (tái sinh)
ionid.
Có 3 loại chất nhồi cột trao đổi ion trong sắc ký lỏng hiệu năng cao:
+ loại hạt xốp nhựa ionid có khung polystyren
+ loại hạt xốp silicagel có gắn các nhóm trao đổi ion
+ loại hạt thủy tinh gắn chất trao đổi ion
* Sắc ký loại theo cỡ: là phương pháp mới được phát triển và chủ yếu áp
dụng cho phân tích các chất có phân tử lượng lớn. Chất nhồi chủ yếu là các
gel, trong gel có các lỗ xốp, các phân tử lớn nằm ngoài lỗ xốp di chuyển dễ
dàng theo dung môi, các phân tử nhỏ hơn có thể nằm một phần trong lỗ xốp,
các phân tử nhỏ nữa có thể chui hoàn toàn vào trong lỗ xốp và khó di chuyển
theo dung môi do đó khi rửa giải các phân tử sẽ ra lần lượt theo cỡ từ lớn đến
nhỏ. Các gel ưa nước được dùng với pha động là dung dịch nước và phương
pháp được gọi là sắc ký lọc trên gel. Nếu các gel kỵ nước thì dùng pha động là



(He), lọc dưới áp suất giảm... nhưng chú ý tránh làm thay đổi nồng độ các
dung môi dễ bay hơi của pha động. Nên đặt bình chứa dung môi ở vị trí cao
hơn so với bơm để tạo áp suất dương.
* Hệ thống bơm: lưu lượng dòng qua cột thường từ 0,1 - 3mL/phút do
đó bơm phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 200 - 250
atm). Vật liệu làm bơm có thể bằng thép không gỉ hay các polymer như PTFE
hoặc PEEK, thép không gỉ chịu được áp suất tới 6000 psi nhưng nhược điểm
là có thể sinh các tạp ion kim loại và các protein có thể bị hấp phụ vào bề mặt
kim loại, các polymer không có các nhược điểm này, có thể chịu được các pha
động có tính ăn mòn (như HCl) nhưng chỉ chịu được áp suất từ 2000 - 4000
psi và lại rất đắt tiền. Bơm có thể là "áp suất hằng định" hay "tốc độ dòng
hằng định", loại "tốc độ dòng hằng định" thuận tiện hơn do dễ thay đổi cột có
kháng áp khác nhau và các loại dung môi có độ nhớt khác nhau. Loại bơm
được sử dụng rộng rãi nhất có pit-tông điện, có dòng hằng định được kiểm


16

soát bởi mô tơ tốc độ, các bơm chỉ có 1 pit-tông thì dòng bị dao động, để có
dòng ổn định bơm cần có 2 hoặc 3 pit-tông.
* Hệ tiêm mẫu:
- Xy lanh tiêm (syringe injection): có thể tiêm trực tiếp qua một tấm
đệm đàn hồi (septum injection) giống như trong sắc ký khí, bị giới hạn áp suất
do đó thường tiêm dưới áp suất thấp hoặc dùng phương pháp "dừng dòng"
(stop flow), tuy nhiên phương pháp vẫn có độ lặp lại kém và không ổn định
- Van tiêm (valve injectors): gồm van chuyển nối với vòng chứa mẫu
(sample loop), khi van ở vị trí "nạp" (load) mẫu được đưa vào vòng chứa
(loop) và dòng dung môi từ bơm tới cột đi qua một đoạn khác của van; khi van
chuyển sang vị trí "tiêm" (inject), vòng chứa mẫu được nối vào dòng giữa bơm
và cột. Vòng chứa mẫu có dung tích xác định và chính xác, độ lặp lại tốt khi

nhất, đèn thủy ngân thường được sử dụng trong detector này, = 254 là bước
sóng sử dụng phổ biến nhất, thống kê cho thấy gần 2/3 các hợp chất hữu cơ
trong phân tích HPLC có khả năng hấp thụ bức xạ này, đặc biệt là các hợp
chất thơm.
+ Detector có bước sóng thay đổi (variable wavelength): có khả năng
cho các bước sóng khác nhau để điều chỉnh theo đặc điểm hấp thụ khác nhau
của các chất (điều chỉnh về cực đại hấp thụ của chất để tăng độ nhạy). Để có
khả năng này, người ta sử dụng một nguồn sáng liên tục (thường là đèn D2) và
bộ đơn sắc phù hợp (thường dùng cách tử).
+ Detector quét (scanning): là một dãy các bước sóng thay đổi cho một
phổ hấp thụ của một chất rửa giải để kiểm tra khi 2 chất rửa giải ra đồng thời
như 1 pic. Phổ hấp thụ đo được bằng cách dừng dòng pha động khi chất rửa
giải nằm trong detector và quét dải sóng đo độ hấp thụ.
+ Detector mảng diod (photodiode array detector: PDA): cho khả năng
quét cực nhanh dải sóng để thu được phổ hấp thụ ngay cả khi dòng pha động
vẫn liên tục chạy.