BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI
HỌC
■
■

BỘ Y TẾ

Dược HÀ NỘI
■

■

LÊ THỊ MINH CHÍNH

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN BRCA1 VÀ BRCA2 ở
CÁC BỆNH
NHÂN UNG THƯ v ú ở VIỆT
NAM
■
■
■

LUẬN VĂN THẠC s ĩ Dược HỌC
CHUYÊN NGÀNH: Dược LÝ-DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 60.73.05

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS ĐINH DUY KHÁNG
GS TSKH ĐÁI DUY BAN



Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất cả các anh
chị đồng nghiệp và bạn bè đã động viền, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 12 năm 2003

Lê Thị Minh Chính


MỤC LỤC

PHẨN 1- ĐẶT VẤN ĐỀ
PHẦN 2- T ồN G QUAN
Một số vấn đề về ung thư và ung thư vú
Một số vấn đề về ung thư
Ung thư vú
Dịch tễ học ung thư vú
Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú
Bệnh sử tự nhiên của ung thư vú
Chẩn đoán ung thư vú
Điều trị ung thư vú
Gen BRCA trong các trường hợp ung thư vú
Kỹ thuật PCR
Real-time PCR
Khái quát chung
Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR
ứng dụng của Real-time PCR
Vector tách dòng
Khái niệm về vector tách dòng

Nội dung nghiên cứu
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Hoá chất, thiết bị
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết ADN
Tách ADN từ sinh thiết ung thư vú
Tách ADN từ máu
Phương pháp xác định nồng độ và độ tinh sạch của
AND bằng đo quang phổ OD 260/280.
Phương pháp điện di
Phương pháp PCR
Phương pháp tinh chế sản phẩm PCR
Phương pháp tạo dòng
Gắn ADNvào plasmid

25
25
26
27
27
27
27
28
28
29
30
31
31
32


Kết quả tách chiết ADN Plasmid từ vi khuẩn E.Coli
Kết quả tinh sạch vector tái tổ hợp
Kết quả xác định trình tự gen

44
47
47
49

Thực hiện phản ứng giải trình tự
Kết quả giải trình tự đoạn ADN mang đột biến 185
delAG exon 2 BRCA 1
Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến 6174 del T
exon 11 BRCA 2

55
57

36

50
54
55

59

Kết quả thực hiện phản ứng Real time PCR

60


Acid Desoxyribonucleic
Amonium persulfate
Acid Ribonucleic
Adenine Triphosphat
base pair
Breast cancer sussepbility gene(gen ung thư vú)
Cytosine Triphosphat
Hỗn hợp deoxynucleotid triphosphat
(dATP+dTTP+dGTP+dCTP)
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EtBr
Ethidium bromide
GTP
Guanine Triphosphat.
Kb
Kilo base
LB
Môi trường thịt để nuôi cấy
MWM
Molecular weight marker (yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử)
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase để nhân
bản các đoạn ADN trong phòng thí nghiêm
PMC
Prophylactic Contratateral Mastectomy (Phương pháp cắt bỏ
tuyến vú còn lại)
PO
Prophylactic Oophorectomy (Phương pháp dự phòng cắt 2 buồng
trứng)

nữ. Tỷ lệ tử vong thay đổi từ 2- 5/100.000 người tại Nhật Bản, Mêxico,
Venezuela đến 25- 35/100.000 người tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan, Hoa Kỳ
và Canada [10]. Tại Việt Nam, theo điều tra ung thư ở Hà Nội năm 1998, tỷ
lệ số người mắc ung thư vú là 20,3/100.000 người, đứng đầu trong các loại
ung thư ở nữ. Theo thống kê của Bệnh viện K, Hà Nội năm 2000, tỷ lệ ung
thư vú là 17,4/100.000 người. Ở các tỉnh phía nam, tỷ lệ ung thư vú ở phụ
nữ là rất cao chỉ sau ung thư cổ tử cung và chiếm tới 27% trong tất cả các
trường hợp ung thư ở phụ nữ [5], [10].
Tỷ lệ ung thư vú trên thế giới có chiều hướng gia tăng, nhưng tỷ lệ tử
vonơ lại có chiều hướng giảm do được chẩn đoán và điều trị sớm. Ngoài các
phương pháp chẩn đoán bằng tế bào học, mô học, gần đây các phương pháp
chẩn đoán trên cơ sở kỹ thuật sinh học phân tử cũng được ứng dụng rất
nhiều trong nghiên cứu và chẩn đoán ung thư vú [3], [11], [17]. Hai gen có
liên quan mật thiết tới quá trình phát triển ung thư vú đã được thế giới
nghiên cứu rất nhiều là BRCA1 và BRCA2. Có nhiều bằng chứng cho thấy
sự đột biến ở hai gen này có thể làm cho nguy cơ ung thư vú gia tăng [26],
[35], [55], [63].
Sự đột biến này rất phức tạp, nhưng hay gặp nhất là đột biến 185
delAG thuộc exon 2 của BRCA1 và 6174 delT thuộc exon 11 của BRCA2
[65], [73], [74]. Chúng tôi tiến hành đề tài: “N ghiên cứu đột biến gen
BRC A1 và BRCA2 ở các bệnh nhân ung th ư vú ở Việt N am ” để góp phần
tìm hiểu mối liên quan giữa ung thư vú và đột biến gen BRCA1,
BRCA2 ở người Việt Nam.


2

Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu đột
biến tại các điểm 185 delAG thuộc exon 2 của BRCA1 và 6174 delT thuộc
exon 11 của BRCA2.

xuất hiện một cách thầm lặng. Những yếu tố tấn công gây ung thư
(carcinogen) như rượu, thuốc lá, các tia bức xạ ion hoá...., thường tác động
nhiều lần với một nsưỡng nhất định. Giai đoạn nàv kéo dài hàng chục năm
cho tới khi khối tế bào ung thư phát triển tới kích thước có thể phát hiện được
trên lâm sàng. Thông thường, khi đó đã là giai đoạn muộn, thời gian sống của
người bệnh không còn được bao lâu. Trong thời gian gần đây, với sự phát triển
của khoa học kỹ thuật y học, khá nhiều bệnh ung thư được phát hiện sớm, điều
trị kịp thời đã kéo dài đáng kể sự sống của người bệnh [5], [11].
Năm 1976, Dominique Stehelin (Pháp) cùng với Michael và Hazold
(Mỹ) đã tìm thấy các tiền gen có khả năng gây ra ung thư (protooncogen) ở .
người. Dưới ảnh hưởng của một số yếu tố, các tiền gen sẽ chuyển thành gen
gây ung thư (oncogen). Hiện nay, người ta đã phát hiện được trên 40 loại
oncogen [2], [13]. Tế bào invitro của người bình thường được cấy các gen gây
ung thư này sẽ chuyển thành tế bào ung thư.


4

Quá trình sinh ung thư được trình bày tóm tắt ở hình 2.1 [2].
Các yếu tố môi trường
độna gồm:
- Các tác nhân hoá học
- Các tia vật lý.

Thay đổi bộ gen

Các yếu tố

của tế bào thân


Ị
B

62
4 5 .7

5

38. s

sa 2 8 . 8

m

SO.7

E

Mĩ. d a đ e n
C a n a d a 33
Mĩ g ố c N hật
Mĩ g ố c T B N
C h â u Âu
Icelan d
P h á p , S a s-R h in
Italia
Đ an M ạch
T h ụ y Đ iể n
S co tlan d
Anh v ả x ứ W a le s

70 3 0

90

H ình 2.2. Tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi (ASR)Ì100.000 dân
ở một s ố nước

100


6

Trong những thập kỷ qua, tỷ lệ ƯTV ngày càng có xu hướng gia tăng.
Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Mỹ, tỷ lệ UTV ở người Mỹ đã tăng từ
80/100.000 người trong năm 1975 tới 105/100.000 người trong năm 1985
và 178/100.000 người trong năm 1998 [55] [63], Nghiên cứu của Nazario
C.M. và cs. cho thấy tỷ lệ mắc ƯTV ở Puerto Rico đã tăng từ 15,3/100.000
người trong giai đoạn 1960-1964 lên 43,3/100.000 trong giai đoạn 19851989 và tỷ lệ chết do ung thư tương ứng với các giai đoạn này tăng từ
5,7/100.000 người lên 10,6/100.000 người[55] Tại vùng Vaud, Thuỵ Sĩ, tỷ
lệ ƯTV đã tăng từ 2,1/100.000 phụ nữ (1977-1979) lên 9,4/100.000 phụ nữ
(1992-1994) [52]. Nghiên cứu của Goelen và cs cho thấy ở Australia tỷ lệ
mắc UTV là 37,0/100.000 người, tỷ lệ này táng theo tuổi (ở nhóm tuổi 5069 là 78,0/100.000 người).
*

Theo báo cáo của Khoo u s và c.s. những năm gần đây, tỷ lệ mắc UTV
ở một số nựớc châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt là ở Nhật Bản,
Hồng Kông và Singapore, nơi có lối sống phương Tày hoá. Điều này gợi ý
đến các yếu tố môi trường, lối sống và đặc biệt là chế độ ăn đóng một vai
trò quan trọng trong sự phát triển ƯTV. Tỷ lệ mắc UTV ở phụ nữ Hồng
Kông hiện là 2,6/1.000 phụ nữ trên 40 tuổi [5] và ở Singapore là 4,8/1.000


50-59

60-69

70 -79

> 80

0,2

4,3

21,1

119,7

142,1

112,5

110,3

24,7

tuổi
Tỷ lệ
mắc

2.1.2.2. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú [2], [5], [10], [26].

trong thời gian dài với ƯTV. Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy cơ
mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng đến 4,1
lần. Dùng hormon thay thế ở phụ nữ mãn kinh là an toàn khi dùng trong
thời gian ngắn. Nhưng dùng với liều trung bình trong thời gian từ 10-20
năm nguy cơ mắc ƯTV tăng từ 1,5-2,0 lần [9], [10].
* C h ế độ ăn
Liên quan giữa UTV với chế độ ăn, đặc biệt là chất béo trong khẩu
phần ăn vẫn còn nhiều tranh cãi. Uống rượu 1-2 lần/ngày có nguy cơ phát

0


9

triển ƯTV gấp 1,2 lần. Rượu có ảnh hưởng nhiều nhất trong phát triển UTV
ở phụ nữ dưới 30 tuổi[2].
* Cấc yếu tố môi trường
Sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hoá từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ
làm tăng nguy cơ phát triển ƯTV. Sự phát sinh UTV có liên quan tới liều
bức xạ, tuổi tiếp xúc. đặc biệt là ở độ tuổi thanh niên.
2.1.2.3. Bệnh sử tự nhiên của ung thư vú
* Đặc điểm tự nhiên của ung thư vú
UTV là loại bệnh diễn biến chậm, chỉ có < 3% số bệnh nhân ƯTV
tiến triển nhanh, dẫn đến tử vong trong vòng vài tháng. Người ta ước tính từ
khi tế bào chuyển biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiện được khối u có
ỷ

kích thước lcm thì mất khoảng 7- 8 năm. Nhưng khối u từ 1 cm phát triển
đến 2 cm thì thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng, ớ thời điểm này, nếu
không được phát hiện và điều trị thì sau 2 năm tế bào uns thư đã di căn vào

UTV chết do bệnh này. Các biện pháp dự phòng UTV đối với các phụ nữ có
nguy cơ cao do yếu tố di truyền là rất có hiệu quả.
* Chẩn đoán xác định:
Chẩn đoán xác định UTV nhất thiết phải có sự khẳng định của tế bào
học và/ hoặc giải phẫu bệnh học [5], [8], [10]. Trên thực tế lâm sàng, UTV
thường được chẩn đoán dựa vào 3 phương pháp: lâm sàng, tế bào học và
chụp X quang tuyến vú. Nếu một trong ba yếu tố này còn nghi ngờ thì bệnh
nhân sẽ được tiến hành làm sinh thiết tức thì để chẩn đoán xác định.
* M ột s ố phương pháp mới chẩn đoán UTV [1], [3], [4].


11

Hiện nay, đã phát triển được một số phươns pháp chẩn đoán và theo dõi
điều trị un 2 thư vú mới như:
- Theo dõi sự biến đổi sinh học của CA 15-3 trong quá trình điều trị
để có cơ sờ dự đoán chính xác mức độ tái phát và di căn của ung thư vú.
- Dựa vào sự biểu hiện và khuếch đại gen Her-2/neu trong ung thư vú
nguyên phát để chẩn đoán và lựa chọn phác đồ điều trị cho thích hợp.
-

Liên quan giữa sự đột biến gen P53 với độ ác tính, di căn và đáp
ứng với phác đồ điều trị.

-

Gen BRCA1 và BRCA2 cũng đang được các nhà nghiên cứu rất
quan tâm. Đột biến 2 gen này dẫn đến ƯTV ở phụ nữ trẻ tuổi
mang tính di truyền.


do các ung thư này, tử vong do ung thư tiên phát và sự giảm tỉ lệ ung thư và
tử vong do các phươns pháp dự phòng bằng phẫu thuật, phẫu thuật phối hợp
với trị liệu bằng tamoxifen hoặc chỉ dùns tamoxifen.
Các phươns pháp được thực hiện dự phòns bao gồm: Dùng tamoxifen
5 năm, PO, PMC và phối hợp các phương pháp , sau đó so sánh hiệu quả
của phương pháp này. Kết quả cho thấy, ở những bệnh nhân lứa tuổi 30 bị
ung thư vú ở giai đoạn sớm với các đột biến BRCA thì có thể kéo dài tuổi
thọ trung bình 0,4 đến 1,3 năm với điều trị bằng tamoxifen, 0,2 đến 0,8
năm với PO và 0.6 đến 2,1 năm với PMC...
2.2. GEN BRCA TRONG CÁC TRƯỜNG HỢP UNG THƯ v ú

Cornelisse C.J. và cs. (1996) cho rằng một trong những yếu tố nguy cơ
quan trọng của ung thư vú là yếu tố di truyền. Các tác giả cũng cho rằng gen
quan trọng nhất chịu trách nhiệm đối với ung thư vú là BRCA1 và BRCA2. Từ
đầu thập kỷ 90, các nghiên cứu về gen liên quan tới ung thư đã bắt đầu được
tiến hành. Hiện có 6 gen BRCA1, BRCA2, P53, Cowden, AR (ADNrogen


13

receptor gene) và TA (ataxia telangiectasia gene), có liên quan nhiều đến ung
thư vú đang được chú trọng nghiên cứu (bảng 2)
Bảng 2.2. Những gen liên quan tới nguy cơ mắc UTV có tính di truyền [10]
Liên quan

Vị trí trên

tới UTV

nhiễm sắc thể

Cao

17p 13.1

Cowden

Hiếm

Cao

10q22-23

Vú

AR

Hiếm

Chưa rõ

X ql 1.2-12

Vú nam

TA

Thườn 2 2 ặp

Thấp


ung thư buồng trứng là 11% ở tuổi 60. Những biến đổi gen BRCA1 ở đàn
ông cũng làm tăna nguy cơ phát triển ung thư tuyến liệt. Easton và cs ước
tính tỷ lệ đột biến gen BRCA1 là 1/700 phụ nữ. .
Một điều đáng chú ý là BRCA1 biểu hiện ở tuổi trẻ hơn (tuổi trung
bình là 42,8 so với ung thư vú chung là 62,9). Những u này thường biểu
hiện tỷ lệ tăng sinh cao và thường có dị bội thể. Tỷ lệ tái phát đối với nhữns
bệnh nhân ung thư vú có đột biến sen BRCA1 thấp hơn so với những ung
thư vú khác.
Có 5 loại đột biến với tỷ lệ cao, chiếm 40% các biến đổi thuộc gen
BRCA1, trong đó đột biến 185 delAG là loại hay gặp nhất, chiếm khoảng
12%. Nếu có đột biến này thì nguy cơ u n ơ thư vú là 16% và ung thư buồng
trứng là 39% ở tuổi 50. Tuy nhiên, Jara L. và cs (2002) nghiên cứu đột biến
185delAG ở 382 trường hợp thuộc các gia đình có tiền sử ung thư vú ở Chilê
thì chỉ tìm thấy 1/382 trường hợp có đột biến 185delAG, chiếm 0.26%.
Laplace- Marieze V. và cs. (1999) đã xác định trình tự vùng m ans mã
thuộc gen BRCA1 để phát hiện đột biến ở 70 gia đình người Pháp có nguy


15

cơ ung thư cao. Đột biến BRCA1 phát hiện thấy ở 24 % các gia đình được
xét nghiệm, ở các gia đình này các trường hợp ung thư vú và ung thư
buồng trứng xuất hiện ở phụ nữ còn tươns đối trẻ, và tồn tại cả hai loại ung
thư là ung thư vú và ung thư buồng trứng ở cùng một bệnh nhân có thể giả
định về khả năn 2 có mặt của các đột biến BRCA1. Tuv nhiên, kết quả cho
thấy tần suất xuất hiện đột biến BRCA1 thấp, như vậy có thể giả định rằng
có một số biến đổi gen không thể phát hiện được trong một số gia đình có
thể là đột biến BRCA2 hoặc BRCAx nào đó chưa xác định được.
Gen BRCA2 nằm trên nhiễm sắc thể 13 q ỉ2 -ỉ 3, được phát hiện vào
tháng 9 năm 1994. Nó là một gen lớn có 27 exon, mã hoá một protein có

sinh y đều được phát triển trên cơ sở kỹ thuật PCR như: kỹ thuật RT-PCR để
nhân bản sợi bổ sung của ARN, RAPD- PCR, Real-time PCR... Một đặc tính
tuyệt vời khác của PCR là có độ nhậy và độ chính xác rất cao, thành phần hỗn
hợp PCR đơn giản.
Nguyên Ịý của PCR tương tự quá trình sao chép ADN trong tế bào, thực
chất là quá trình tổn 2 hợp ADN invitro nhờ enzvm ADN polymerase chịu
nhiệt. Các bước cơ bản của PCR gồm:
- Biến tính ADN khuôn sợi đôi nhờ nhiệt độ cao: ADN sợi đôi trong đó
có đoạn ADN đích cần phân lập và nhân bản sẽ tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt
độ cao (thường ở 94- 96°C), tạo điều kiện cho mồi bám vào.
- Lai mồi (primer) với khuôn ADN sợi đơn: khi nhiệt độ hạ thấp, cặp
mồi (là các oligonucleotide thường có trên dưới 20 nucleotide) có khả năng
bám (lai) vào ADN sợi đơn. Điều khiển nhiệt độ bám thích hợp sẽ tạo khả
năng cho mồi bám vào đúng vị trí mong muốn. Số lượng mồi rất lớn sẽ cạnh
tranh tốt với sự bám trở lại của sợi đôi ADN khuôn ban đầu.
- Tổng hợp sợi ADN mới: ngay sau khi mồi bám vào ADN khuôn,
enzym ADN polvmerase sẽ tổng hợp sợi ADN mới trên cơ sở kéo dài đầu 3 ’
của mồi, bằng cách gắn liên tiếp 4 loại nucleotide theo nguyên tắc bổ xung
theo sợi ADN đơn làm khuôn mẫu. Nhiệt độ sẽ nâng cao dần đến nhiệt độ tối


17

ưu cho enzym ADN polymerase hoạt động (thườns trong phạm vi 68- 72°C)
trong một thời gian ngắn. Sau đó nhiệt độ sẽ tăng lên cho quá trình biến tính
ADN khuôn đê’ bắt đầu một chu kỳ mới.
Chu kỳ trên lặp lại nhiều lần (thường từ 25 - 40 lần). Các sợi mới tổng
hợp trong chu kỳ trước sẽ đóng vai trò sợi ADN khuôn trons chu kỳ sau và tốc
độ tổng hợp sợi ADN mới sẽ tăng theo cấp số nhân, tạo hàng triệu bản sao sợi
ADN mới trong một thời gian ngắn, đáp ứng số lượng cho yêu cầu nahiên cứu.


-

Đây là phương pháp rất hữu hiệu để phát hiện nhanh các đột biến.

2.4.2. Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR
+ Sử dụng SYBR Green I:
Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR sử dụng SYBR Green I được
nêu ở hình 2.3.
SYBR Green I là một hợp chất hoá học đặc biệt, chỉ có thể liên kết với
ADN khi ADN ở dạng sợi kép, chúng nằm trong khe hở được tạo ra giữa 2 sợi
ADN. Chỉ ở dạng liên kết, SYBR Green I mới phát quang. Dạng tự do hầu như
không phát quang. Trong ống phản ứng, khi ADN ở dạng sợi đơn thì SYBR
Green I tồn tại ở dạng tự do và không phát quang (A). Sau khi primer bắt cặp
với sợi khuôn, SYBR Green I bắt đầu liên kết với ADN và phát quang (B).
Trong quá trình kéo dài chuỗi, đoạn ADN sợi kép dài dần, lượng SYBR Green
I liên kết cũng tăng dần kéo theo sự tăng dần của mức độ phát quang (C). sản
phẩm PCR tăng theo cấp số nhân vì vậy cường độ phát quang cũng tăng theo
theo chu kỳ của phản ứng (D). Bộ detector trong máy chuyên dụng sẽ nghi
nhận và xử lý nhờ phần mềm. Lượng sản phẩm PCR sẽ được nhận biết theo
từng thời điểm trên màn hình máy tính và lưu vào bộ nhớ.
>1 B_*»|s«p2ltaaB«d|S*l>3*

+ Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR dựa trên sự bắt cặp của các
mẫu dò đặc hiệu
Nguyên lý bắt cặp của các mẫu dò đặc hiệu (hay còn gọi là nguyên lý
phát quang nhờ chuyển năng lượng cộng hưởng) được mô tả ở hình 2.4. Hai
mẫu dò đặc hiệu số 1 và số 2 được gắn hai hợp chất phát quang khác nhau.
Fluorescein ở đầu 3’ của mẫu dò số 1 và LC Red ở đầu 5’ của mẫu dò số 2.
Khi mẫu dò số 1 và mẫu dò số 2 ở dạng tự do thì LC Red không phát quang vì
ở xa Fluorescein và không nhận được năng lượng từ Fluorescein (A). Sau khi
mẫu dò số 1 và mẫu dò số 2 bắt cặp vào khuôn thì LC Red phát quang vì nhận
được năng lượng từ Fluorescein (B). Quá trình tổng hợp chuỗi được tiến hành
qua mỗi chu kỳ của PCR làm cho lượng sản phẩm PCR tăng dần (C,D). Số
lượng mẫu dò số 1 và 2 bắt cặp vào khuôn cũng tăng dần và cường độ phát
quang của LC Red cũng tăng theo. Detector của máy chuyên dụng sẽ nhận túi
hiệu phát quang của LC Red nhờ bộ lọc thích hợp với bước sóng của LC Red.

*

p y 00 2

mwr inmnTl

Itinim

MTTfflfM

/

Hình 2.4. Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên sự bắt cặp của
các mẫu dò (Probes) đặc hiệu.