ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ TƯƠI

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU
HIỆN GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
(Nicotiana tabacum L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ TƯƠI

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN
GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
(Nicotinana tabacum L.)
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Tiến Dũng
CHỮ KÝ PHÒNG QLĐTSĐH CHỮ KÝ KHOA CHUYÊN MÔN

CHỮ KÝ GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN


MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ........................................ vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa của luận văn .................................................................................. 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3
1.1.Giới thiệu chung về cây thuốc lá................................................................. 3
1.1.1. Phân loại học .......................................................................................... 3
1.1.2. Các đặc điểm thực vật học của cây thuốc lá .......................................... 4
1.2. Giới thiệu về gen CBF1 ............................................................................. 5
1.3. Tính chống chịu của thực vật ..................................................................... 8
1.3.1.Tính chịu hạn............................................................................................ 8
1.3.2. Tính chịu nóng....................................................................................... 11
1.3.3 Tính chịu lạnh ........................................................................................ 13
1.4. Ảnh hưởng của stress nóng, hạn, lạnh đến cây trồng .............................. 14
1.4.1. Ảnh hưởng của stress nóng ................................................................... 14
1.4.2. Ảnh hưởng của hạn ............................................................................... 15
1.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lạnh ................................................................ 16
1.5. Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu ở thực vật..................................... 17
1.6. Phương pháp chuyển gen ở thực vật qua Agrobacterium ........................ 20


iii
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 23
2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ................................................. 23

iv
3.1.1. Phân tích gen AtCBF1 trên cơ sở dữ liệu database ............................. 39
3.1.2. Tách dòng gen AtCBF1 ......................................................................... 40
3.2. Thiết kế vector chuyển gen ...................................................................... 45
3.3. Chuyển gen AtCBF1 vào cây thuốc lá thông qua A.tumerfaciens ........... 45
3.4. Chọn lọc và phân tích hiệu quả chuyển gen ............................................ 47
3.5. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AtCBF1 trên cây thuốc lá .......... 49
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 53
4.1. Kết luận .................................................................................................... 53
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 24
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .......................................... 27
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 27
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .................................................... 28
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid......................................... 30
Bảng 2.6. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen........................ 35
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 37
Bảng 2.8: Chương trình thực hiện phản ứng PCR .......................................... 38
Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen trên môi trường bổ sung
Kanamycin 25mg/l. ......................................................................................... 47


vi

EDTA
Kb
kDa
LB
LB
MAS
MCS
MS
NAA
NAD
NIL
NOS
OD
PCR
PMI
QTL
RB
RMOP
RNA
ROS
RFLP
SDS
TAE
T-DNA
TE
Ti - plasmid
UV
Vir

Adenosine Diphotphat

Ribonucleic Acid
Reactive Oxygen Species
Restriction Fragment Length Polymorphismtg
Sodium Dodecyl Sufate
Tris bazơ - Axit acetic – EDTA
Tranfer - DNA
Tris HCl - EDTA, pH = 8
Tumor inducing plasmid
Ultraviolet
Virulence


1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng, sinh
sản và năng suất cây trồng. Nhiệt độ thấp dẫn đến những thay đổi về hình
thái, sinh hóa hay các cơ chế phân tử trong cây từ đó làm giảm khả năng sinh
trưởng, năng suất của cây thập trí gây chết hoặc thất thu hoàn toàn. Ở cây
chịu lạnh khi gặp nhiệt độ thấp cây thay đổi cấu trúc tế bào và vai trò của các
enzyme tham gia quá trính trao đổi chất của tế bào để thích ứng với ngoại
cảnh.
Nghiên cứu tạo cây chịu lạnh được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới
và mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn tạo giống. Bằng các kỹ thuật
sinh học phân tử nhiều gene liên quan đến khả năng chịu lạnh đã được sàng
lọc và phân tích trên cây trồng như COR15a (Artus và cộng sự, 1996),
WCS120 (Houde và cộng sự, 1992), COR78/RD29, COR47 (Thomashow,
1999), CBF (Hsieh và cộng sự, 2002; Dubouzet và cộng sự, 2003; Ito và cộng
sự, 2006).
CBF (C-repeat binding factor) là một nhóm gene có mặt trong nhiều loại

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đánh giá khả năng tính chịu lạnh ở cây thuốc lá được sử dụng
làm cơ sở để đánh giá và ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng chịu lạnh của
cây trồng.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá
1.1.1. Phân loại học
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana.sp thuộc ngành hạt kín
Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotyledones, chi Nicotiana. Trong chi
Nicotiana có 50 – 70 loài, đa số dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là
dạng dại phụ. Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta chia thành 4
loại chính [13]:
- Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tươi. Đây là loại
phổ biến nhất, chiếm 90% diện tích trồng thuốc lá trên thế giới [13].
- Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích
thuốc lá trên thế giới [13].
- Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím,
thường chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dự trữ gen cho lai tạo, ít
được dùng trong sản xuất [13].
- Loài Nicotiana polideiede L.: có hoa màu trắng. Loài này cũng ít
được dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số
quốc gia [13].
Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị kinh tế vừa là cây
mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng nhờ khả
năng dễ dàng tiến hành nuôi cấy mô và tiến hành chuyển gen. Vì vậy, thuốc lá

Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ [13].


5
1.1.2.4. Hoa
Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, năm cánh, nhị cái ở giữa, xung
quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,
được hình thành do sự phân hóa của đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa
chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của
chùm hoa [14].
Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối, còn lại có thể do thụ
phấn chéo do gió, côn trùng,...
1.1.2.5. Quả và hạt
Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100- 150 quả
trên mỗi chùm hoa có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên
chùm hoa.
Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng
sấy lò là khoảng 0,07 – 0,1gam. Trong mỗi gam hạt có từ 10.000 – 15.0000
hạt [14].
1.2. Giới thiệu về gen CBF1
Đặc điểm: Gen CBF1 hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa
DRE/CRT và gây ra sự biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả
năng chịu lạnh của cây trồng. Nó mã hóa một thành viên của phân họ DREB
A-1 của họ hệ số phiên mã ERF/AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền
AP2. Có bốn thành viên của họ CBF, đáp ứng với stress phi sinh học của cây.
Ba gen đầu tiên là CBF1 CBF2 và CBF3, rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt
độ lạnh, trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi có khô hạn xảy ra.
Gen CBF1 này liên quan đến phản ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [48].
Các nghiên cứu về gene CBF1: Để khai thác tốt chức năng khác nhau
giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây trồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây

gen trong Populus trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả


7
định; các gen được xác định tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh
học. Hầu như tất cả các gen mục tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động
cis mà trung gian phản ứng với các tín hiệu môi trường và nội sinh khác nhau,
phù hợp với vai trò quan trọng của CBF1 trong một mạng lưới điều hòa lạnh
tích hợp. Cuối cùng, phân tích 528 cá thể của Populus simonii đã xác định sáu
đa hình đơn nucleotide (tỷ lệ phát hiện sai Q
nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô hạn đến [3].


9
Hai cơ chế chủ yếu liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật là sự
điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển mạnh của bộ rễ. Bộ rễ là một
trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung
cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Cơ chế chịu hạn
liên quan mật thiết với sự phát triển của bộ rễ. Cơ thể thực vật thích ứng với
hạn bằng cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vươn tới các lớp đất sâu hơn để
hút nước dễ dàng hơn, đồng thời hệ thống rễ con phát triển mở rộng theo bề
ngang có thể thích ứng tốt với việc tìm kiếm dinh dưỡng khoáng và nước
trong lòng đất [31]. Kaspar và cộng sự khi đánh giá 105 giống đậu tương
trong điều kiện khô hạn đã nhận thấy, cây đậu tương không được tưới nước
thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn cây đậu tương được tưới nước, ngoài ra các nhà
khoa học cũng nhận thấy mối tương quan chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ
như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ con ở các
giống chịu hạn. Các tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan
trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn [29].
Hệ thống xử lý hạn cho cây mô hình A. thaliana đã được Amal Harb và
cộng sự (2010) thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của cây khi bị hạn. Kết
quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua ba giai đoạn:
giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp ứng
chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [2]. Thực vật đáp
ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và
không phụ thuộc ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi
trường được tế bào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường
hoặc thông qua ABA hoặc không thông qua ABA. Các tín hiệu được dẫn
truyền đến nhân gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố
phiên mã. Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen



11
các gen, được điều khiển bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF,
HD-ZIP, MYB, Bhlh, NAC, NFY, EAR và ZPT2 [46]. Những yếu tố phiên
mã này được kích hoạt bởi các tín hiệu hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng
lên về hàm lượng ABA, một vài yếu tố phiên mã được kích hoạt bởi ABA.
Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA (ABFs) chủ yếu thuộc họ bZIP và
kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong các promoter của các gen
đáp ứng hạn [26], [46]. Trong khi đó, sự hoạt động của một số gen mã hóa
yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc ABA.
Tuy nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gen mã hóa yếu
tố phiên mã thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ
thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. APETALA2/ethylene response
element - binding protein (AP2/EREBP) là họ yếu tố phiên mã chính trong
các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana, gồm 147 gen, chiếm 9% các yếu tố
phiên mã [17]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200 gen yếu tố phiên mã AP2 đã
được báo cáo. Các AP2/EREBP được đặc trưng bởi sự có mặt của
DNAbinding domain, được gọi là AP2 domain, chứa khoảng 68 amino acid
[21], [35]. Dựa vào sự có mặt của một hoặc hai AP2 – DNA - binding
domain, họ gen này được chia thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV.
Phân họ AP2 mã hóa cho các protein có hai AP2 domain và các protein này
liên quan đến các quá trình sinh trưởng như phát triển các mô phân sinh, các
bào quan và sự phát triển hoa. Các phân họ DREB (dehydration - responsive
element binding), ERF (ethylene - responsive factor) và RAV (related to
ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một AP2 domain và các thành viên
trong phân họ gen này liên quan đến hệ thống truyền tín hiệu [20], [39].
1.3.2. Tính chịu nóng
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của
thực vật trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối



13
nucleoprotein, lipoprotein cao và bền vững giúp cây chịu được nhiệt độ cao.
Đặc biệt ở nhóm cây này có khả năng tổng hợp protein sốc nhiệt (SHPs)
mạnh hàm lượng SHPs cao nên khả năng chịu nhiệt rất cao do các loại protein
này có thể chịu được nhiệt độ cao [1].
1.3.3 Tính chịu lạnh
Đối với thực vật, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hình thái, chức năng sinh lý
và khả năng sinh sản. Nhiệt độ thấp có ảnh hưởng đến hình thái củacây.
Parlovscaia

(1948)

đã

làm

thí

nghiệm

với

cây

Cốc-xa-ghi

(Taraxacumkoksaghyz) thấy rằng trong điều kiện ánh sáng và độ ẩm
giống nhau, nếu để cây ở nhiệt độ 6oC lá xẻ thuỳ sâu, ở nhiệt độ 15 -18oC

Sự có mặt và phồn thịnh của thực vật ở một nơi nào đó, thường phụ
thuộc vào cả tổ hợp các điều kiện. Nhiệt độ và độ ẩm là 2 yếu tố giới hạn, tùy
thuộc vào khả năng năng chống chịu của sinh vật mà biên bộ giới hạn rộng
hay hẹp [22].
Trong tự nhiên thực vật chỉ tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định,
giới hạn nhiệt độ thích hợp với đa số thực vật thay đổi từ 1oC đến 45oC. Tuy
nhiên cũng có những loài thực vật có khả năng duy trì hoạt động sống của
mình vượt qua giới hạn nhiệt độ bình thường nhưng số này không nhiều.
Nhiệt độ cao gây nên sự đông kết protein dẫn đến sự tổn hại nguyên sinh chất.
Đa số cây không chịu được nhiệt độ trên 50oC kéo dài. Trước hết nhiệt độ cao
phá hủy các cấu trúc của các bào quan của tế bào và của các cơ quan của cây.
Ty thể, lục lạp đều bị tổn thương nặng ảnh hưởng đến chức năng hô hấp và
quang hợp. Lá cây bị cháy sém giảm khả năng quang hợp và thoát hơi nước.
Khi gặp nhiệt độ cao cả quang hợp lẫn hô hấp đều bị ảnh hưởng. Khi nhiệt độ
tăng mạnh cường độ quang hợp giảm mạnh hơn tốc độ hô hấp. Trên ngưỡng
nhiệt sinh lý quang hợp không thể bù đủ lượng cơ chất cho hô hấp, do vậy dự
trữ gluxit sẽ giảm. Do vậy, sự mất cân bằng giữa hô hấp và quang hợp là một
trong những nguyên nhân chủ yếu gây hại cho cây của nhiệt độ cao. Nhiệt độ
cao làm giảm tính bền vững của màng và protein. Khi nhiệt độ cao tính lỏng
quá cao làm thay đổi cấu trúc của màng, làm cho màng mất các chức năng


15
sinh lý, để ngoại thấm các ion ra ngoại bào. Nhiệt độ cao kích thích quá trình
phân hủy mạnh sản phẩm tích tụ nhiều trong tế bào là NH3 gây độc cho tế
bào. Nhiệt độ cao cũng làm giảm axit hữu cơ và nhiều hợp chất hữu cơ quan
trọng khác do bị phân hủy. Đặc biệt, nhiệt độ cao làm cho hô hấp mạnh nhưng
sự tích lũy năng lượng vào ATP qua quá trình photphoryl hóa bị hạn chế nên
phần lớn nhiệt thải ra trong hô hấp ở dạng nhiệt làm tăng nhiệt nội bào làm
cho tế bài bị tổn thương và có thể bị chết [26].

phát triển của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng
và dẫn đến sự tăng cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là
do sự kích hoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất
điều chỉnh thẩm thấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [10].
Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp: Sự thiếu hụt nước làm khí khổng
đóng lại. Điều này làm giảm hàm lượng carbon dioxide trong mô lá và cản trở
quá trình quang hợp. Sự hạn chế carbon dioxide do kéo dài thời gian đóng khí
khổng trong điều kiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả
năng vận chuyển electron, điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng
cường các dạng ROS (reactive oxygen species). ROS là các phân tử hóa học
chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như superoxide,
hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gây tác
động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và RNA), protein
và lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế
tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng
hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [31].
1.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lạnh
Nhiệt độ thấp ức chế sự hút nước của hệ rễ và sự vận chuyển nước của
hệ mạch. Đồng thời nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quang hợp của lá, làm
giảm hô hấp, ức chế các quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp protein do các
enzim hoạt động yếu. Ở nhiệt độ thấp màng nguyên sinh chất bị tổn hại làm