TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN
VÀ LƯU TRỮ OLIGONUCLEOTIDE
(PRIMER) SẢN XUẤT TẠI
CÔNG TY SINH HÓA PHÙ SA,
ỨNG DỤNG TRONG KĨ THUẬT PCR
Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU THANH
Người thực hiện: NGUYỄN DUY PHƯƠNG
Lớp
Khoá

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

: 14060302
: 2014 - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của tất
cả mọi người.
Lời đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
khoa Khoa Học Ứng Dụng đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị nhân viên của công ty TNHH MTV Sinh
hóa Phù Sa và các anh chị trong ban quản lý phòng thí nghiệm đã tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến thầy Nguyễn Hữu Thanh



TÓM TẮT
Với mục đích kiểm tra chất lượng của Oligonucleotide (Primer) trong kỹ thuật PCR
sau một thời gian sử dụng và đưa ra được khoảng điều kiện bảo quản khác nhau nhằm
đảm bảo giữ được chất lượng tốt nhất nên đề tài “Khảo sát các điều kiện bảo quản và
lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất tại công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng
trong kĩ thuật PCR” được khảo sát ở 3 điều kiện với hàm lượng phần trăm GC 32%
(GC thấp), GC 50% (GC trung bình), GC 68% (GC cao): Khảo sát điều kiện nhiệt độ
ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide (Nhiệt độ môi trường, nhiệt độ 4 oC, nhiệt
độ -20 oC; Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide (pH=5,
pH=7, pH=9) so với điều kiện bảo quản thông thường trong TE 1X (pH=8.5) . Ba cặp
mồi GCF/R với trình tự:
GC32.Fw: AAAATCTGACTTTAGCACTAGATTC
GC32.Rw: TCAAACGAAACATTGTTACTGATGA
GC50.Fw: GCGAGCTTACTCATCACCAATCTG
GC50.Rw: GCTAACAGGACATTGCTACGTGAG
GC68.Fw: GGCGAGCTGACCCAGCACCCGATCT
GC68.Rv: GCTAGCAGGACGGTGCGCAGTGAGC
Cặp mồi GC32F/R có nhiệt độ gắn mồi thích hợp là 54,2 0C, cặp mồi GC50F/R có
nhiệt độ gắn mồi thích hợp là 60,2 0C, cặp mồi GC68F/R có nhiệt độ gắn mồi thích
hợp là 69 0C. Ba cặp mồi với chu kỳ nhiệt là Biến tính ban đầu: 95 0C trong 2 phút.
Khuếch đại 35 chu kỳ gồm các bước: Biến tính ở 95 0C trong 30 giây; Gắn mồi ở nhiệt
độ phù hợp với GC32F/R, GC50F/R, GC68F/R trong 30 giây; Kéo dài ở 72 0C trong
45 giây. Kéo dài cuối cùng ở 72 0C trong 5 phút. Ủ bảo quản ở 25 0C trong 2 phút. Ba
cặp mồi GCF/R phát hiện mẫu DNA với kích thước 550 bp đã được dòng hóa vào
Plasmid PUC19 (kích thước 2686bp).


MỤC LỤC

Deoxyribonucleotic Acid
Ethylenediaminetetraacetic acid
Tris – acetate - EDTA
Trách nhiệm hữu hạn một thành viên
“TE” có nguồn gốc từ các thành phần của nó: Tris, EDTA
và một phân tử Mg2+
Primer có Hàm
Forward/Reverse
Melting temperature
Thermus aquaticus
Kilobase
Base pair
Nano gam/micro Lit
Nước khử ion
Nhiệt độ

lượng

GC

32%,

50%,

68%


DANH MỤC HÌNH ẢNH
..................................................................................................................................... 35
Hình phụ lục 1e, 1f, 1g, 1h.........................................................................................36

Sinh Hóa Phù Sa đã nghiên cứu và phát triển thành công chất mang rắn HIGH
PERFORMANCE Frit nhằm tối ưu hóa thời gian và gia tăng chất lượng Oligo.


Bên cạnh việc ứng dụng oligo trong các kỹ thuật sinh học phân tử đặc biệt trong
kỹ thuật PCR, vậy làm cách nào để duy trì chất lượng và sử dụng Oligo một cách tốt
nhất trong khoảng thời gian nhất định? Với đề tài “Khảo sát các điều kiện bảo quản và
lưu trữ Oligonucleotide (Primer) sản xuất tại công ty Sinh Hóa Phù Sa, ứng dụng trong
kĩ thuật PCR” được thực hiện với mục đích đưa ra các điều kiện bảo quản tối ưu
Primer và cung cấp cho khách hàng thông tin sử dụng và bảo quản thích hợp để có thể
sử dụng chúng với chất lượng tốt nhất, và làm tiền đề cho các hướng nghiên cứu tiếp
theo.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện bảo quản khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng Oligo và
được kiểm tra, so sánh kết quả bằng phương pháp PCR
1.3 Đối tượng nghiện cứu
Các đoạn Primer có hàm lượng GC khác nhau, DNA được tổng hợp bởi công ty
Sinh Hóa Phù Sa
1.4 Nội dung nghiên cứu
Các đoạn Oligonucleotide ban đầu được khảo sát có hàm lượng GC khác nhau
• Khảo sát điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide
• Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến chất lượng Oligonucleotide


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 Giới thiệu vấn đề nghiên cứu
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào về đề tài liên quan đến bảo quản
Oligonucleotide (Primer). Tuy nhiên, hiện nay có một vài công ty đã phát triển được

Nucleic được 6 tuần. [15]. Kế đó là Công ty Bio SYNTHESIS hướng dẫn cách bảo
quản Oligonucleotide để tránh trường hợp lặp lại nhiều lần chu kỳ đóng băng
Oligonucleotide, vì vậy nên chia nhỏ lượng Oligonucleotide ra làm nhiều phần sử
dụng trong khoảng 1-2 lần chu kỳ đóng băng, sau đó lưu trữ trong dung dịch ở nhiệt
độ -20 oC sẽ được 1-6 tháng, ở nhiệt độ môi trường được 1-7 ngày. Đối với Oligo lưu
trữ dạng đông khô ở nhiệt độ -20 oC sẽ được 6 tháng đến 2 năm, ở nhiệt độ môi trường
được 2 tháng đến 1 năm. [14]
2.2 Lược khảo về vấn đề nghiên cứu
2.2.1 Oligonucleotide
Theo báo cáo của công ty Twist Bioscience tại San Francisco cho biết sau khi
James Watson và Francis Crick đã mô tả thành công sợi đôi DNA, đến năm 1955
Michelson và Todd lần đầu tiên đã tổng hợp thành công dinucleotide TpT và cũng là
nguồn gốc tạo ra thuật ngữ Oligonucleotide. [13]
Oligonucleotide hay gọi tắt là Oligos là những đoạn DNA/RNA ngắn và chúng
được tạo thành bởi sự liên kết của nhiều phân tử nucleotide. Chúng được tổng hợp
bằng phương pháp hóa học trong phòng thí nghiệm và chúng là nền tảng cho sự phát
triển trong sinh học phân tử, sinh học tổng hợp và công nghệ sinh học.


Oligonucleotide thuộc một loại deoxynucleotide luôn đóng một vai trò quan trọng
trong sinh học phân tử hiện nay. Oligos được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau
như PCR, qPCR, sàng lọc gen, chuẩn đoán bệnh, giải trình tự,… [17] và có lẽ phương
pháp PCR là phương pháp phổ biến nhất hiện nay với các mục đích nhằm khuếch đại,
nhân bản, phát hiện đột biến,… các đoạn gen.
Các Oligonucleotide thường được thiết kế và tổng hợp từ 13-25 nuclotide, chúng
được sử dụng làm đầu dò để phát hiện các trình tự gen cụ thể mà chúng có thể bắt cặp
bổ sung với trình tự đó. Sau khi bắt cặp với trình tự mục tiêu, nhằm phát hiện sự bắt
cặp đó, nó thường được kiểm tra bằng cách cho liên kết với một điểm đánh dấu huỳnh
quang đã được thiết kế riêng. Chính vì thế, Oligonucleotide mang một chức năng quan
trọng nhất trong ứng dụng làm đầu đò phân tử để phát hiện các trình tự DNA hoặc

• Bước 2: Bắt cặp (Annealing): nhiệt độ được hạ xuống, thấp hơn nhiệt độ nóng
chảy (melting temperature – Tm) của mồi, tại đó mồi bắt cặp bổ sung với mạch
khuôn DNA. Nhiệt độ bắt cặp dao động từ 50 0C – 70 0C. Mỗi mồi có một nhiệt
độ nóng chảy riêng nên thời gian bắt cặp có thể kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
• Bước 3: Kéo dài (Elongation – Extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72 0C
tạo điều kiện tối ưu cho DNA polymerase hoạt động. Dưới sự tác động của
DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào ví trí theo sau mồi theo
nguyên tắc bắt cặp bổ sung với mạch khuôn. Thời gian kéo dài tùy thuộc vào độ
dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường trong khoảng từ 30 giây đến vài
phút.
3

Thành phần tham gia phản ứng

Theo Frank H. Stephenson và cs., (2016), gồm các thành phần chủ yếu [7] :
• DNA/RNA mạch khuôn
DNA mạch khuôn chứa đoạn DNA hoặc đoạn gen mục tiêu cần khuếch đại như
DNA mạch thẳng, DNA mạch vòng, DNA plasmid, cDNA hoặc RNA,…
• Mồi (primer)
Mồi là một đoạn nucleotide ngắn (oligonucleotide) hỗ trợ cho quá trình nhân đôi
của DNA cần khuếch đại trong phản ứng PCR. Mồi có một số loại như mồi phổ quát,
mồi đặc hiệu, mồi thoái hóa và mồi có gắn phóng xạ đanh đâu huỳnh quang. Vì thế,


một trong những yếu tố quyết định độ đặc hiệu của phản ứng PCR là sự lựa chọn đúng
loại mồi cần sử dụng, vì nếu lựa chọn sau mồi sẽ làm ảnh hưởng lớn đến kết quả của
phản ứng. Do đó, phải tìm hiểu càng nhiểu thông tin về trình tự DNA thì càng dễ chọn
được mồi tốt nhất. Cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược sẽ bắt cặp bổ sung vào hai
đầu của đoạn DNA mục tiêu đồng thời quyết định độ đặc hiệu của một phản ứng PCR.
Tiêu chuẩn của mồi:

DNA polymerase hoạt động tốt khi có sự xuất hiện của ion Mg 2+. Mỗi phản ứng
PCR cần một nồng độ ion Mg2+ khác nhau. Nếu nồng độ Mg2+ thấp thì phản ứng không
đặc hiệu, tạo ra ít sản phẩm PCR. Nếu nồng độ Mg 2+ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ.
Mg2+ được bổ sung trong phản ứng PCR thường ở dạng MgCl2.
2.2.3 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di
4

Nguyên tắc

Điện di là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các đoạn DNA, RNA hoặc
protein dựa trên kích thước và điện tích của chúng. Dựa trên kích thước và điện tích
của phân tử và nhờ và dòng điện trường, chúng sẽ di chuyển qua gel theo các hướng
khác nhau hoặc ở tốc độ khác nhau, cho phép chúng có thể tách ra khỏi nhau. Khi các
phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, tùy vào điện tích của chúng mà
chúng sẽ di chuyển về cực âm (-) hay cực dương (+). Các acid nucleic mang điện tích
âm vì chúng có gốc phosphate mang điện tích âm, vì thế khi đặt trong môi trường tích
điện, nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Phương pháp này sử dụng một dung
dịch đệm dẫn điện và tạo môi trường điện trường đồng nhất, tiếp đến là một bản gel
giúp phân tách các phân tử, đồng thời sử dụng chất nhuộm phân tử để có thể phát hiện
vị trí các phân tử trên gel sau khi thực hiện kỹ thuật điện di. Tùy vào mục đích khác
nhau mà ta sử dụng các bản gel khác nhau như: gel polyacrylamide được dùng để phân
tách các phân tử protein và các phân tử DNA có chiều dài nhỏ hơn một kilobase pair


(kb, 1 kb = 1000 base pair_bp), còn gel agarose phân tách hiệu quả các phân tử DNA
hoặc RNA có kích thước từ 100 bp - 25 kb [8]. Tuy nhiên, sự lựa chọn giữa gel
agarose và gel polyacrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chi phí, độ phân tách,
…
5


Bảng 3.1 Trình tự đoạn Primer
Oligo
name
GC32.Fw
GC32.Rv
GC50.Fw
GC50.Rv
GC68.Fw
GC68.Rv

Trình tự (5'-3')

%GC

Tm

Length

AAAATCTGACTTTAGCACTAGATTC
TCAAACGAAACATTGTTACTGATGA
GCGAGCTTACTCATCACCAATCTG
GCTAACAGGACATTGCTACGTGAG
GGCGAGCTGACCCAGCACCCGATCT
GCTAGCAGGACGGTGCGCAGTGAGC

32
32
50
50
68

200
A1
A2
A3
A4
A5
A6
GC50
156.3
B1
B2
B3
B4
B5
B6
GC68
171
C1
C2
C3
C4
C5
C6

Nồng độ (Copies)
5.6 x 1010
1010
109
108
107

5 µl DNA + 19 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O
10 µl DNA + 90 µl Bi.H2O

3.3.3 Phương pháp tiến hành
6

Lựa chọn mồi và DNA

 Cặp mồi được thiết kế có hàm lượng GC 32 % được thực hiện phản ứng PCR với
DNA Plasmid GC32


 Cặp mồi được thiết kế có hàm lượng GC 50 % được thực hiện phản ứng PCR với
DNA Plasmid GC50
 Cặp mồi được thiết kế có hàm lượng GC 68 % được thực hiện phản ứng PCR với
DNA Plasmid GC68
7

Dung dịch bảo quản và nhiệt độ lưu trữ

Các Primer sau khi được tổng hợp và pha loãng về nồng độ 10 pmol/µL và bắt đầu lưu
trữ từ ngày 29/10/2018 trong dung dịch Bi.H 2O lần lượt có pH = 5, pH = 7, pH = 9 và
trong dung dịch bảo quản thông thường là TE 1X có pH = 8.5. Sau đó, ở tất cả các điều
kiện pH đều được chia đều thành 3 phần và bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau là nhiệt
độ môi trường, nhiệt độ mát, nhiệt độ đá.
Ký hiệu:

Ta = Tm - 5
69
60.2
54.2


Thí nghiệm 1: Kiểm tra kích thước sản phẩm sau phản ứng PCR
Mục đích: kiểm tra xem Primer có bắp cặp đúng với DNA Plasmid không
Thang DNA chuẩn do công ty Sinh Hóa Phù Sa cung cấp
Bố trí thí nghiệm:
-

Các Primer có hàm lượng GC 32%, 50 %, 68 %
Dung dịch lưu trữ: TE 1X
Nhiệt độ lưu trữ: -20 oC
Số lần lặp lại: 2
Số đơn vị thí nghiệm: 2 x 3 = 6

Tiến hành thí nghiệm
-

Pha mix cho phản ứng PCR với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4 Thành phần tham gia phản ứng PCR

Thành phần

Nồng độ gốc

H2O khử ion
(Bi.H2O)


-

Tiến hành thí nghiệm với từng Primer vì mỗi Primer có nhiệt độ bắt sặp khác nhau

-

như được trình bày ở bảng 3.3
Sau đó tiến hành thực hiện phản ứng PCR trong 35 chu kỳ với chu kỳ nhiệt được mô
tả như sau:

95 °C

95 °C

3 phút

30 giây

72 °C 72 °C
45 giây 5 phút
Ta
30 giây

Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khảo sát mồi

25 °C
2 phút



- Số lần lặp lại: 3
 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình bảo
quản Oligo
Bố trí thí nghiệm:
-

Nhiệt độ bảo quản khảo sát: nhiệt độ môi trường, nhiệt độ mát, nhiệt độ đông

-

đá
Oligo có hàm lượng GC: 50%
Tất cả các Oligo được bảo quản trong dung dịch TE 1X (pH = 8.5)
Thời gian khảo sát: 10 tuần
Số lần lặp lại: 3


 Thí nghiệm 2.3: Khảo sát sự ảnh hưởng của dung dịch bảo quản đến quá
trình bảo quản Oligo
Bố trí thí nghiệm:
-

Dung dịch bảo quản khảo sát: Bi.H 20 (pH = 5), Bi.H20 (pH = 7), Bi.H20 (pH

= 9), TE 1X (pH = 8.5)
- Oligo có hàm lượng GC: 50%
- Tất cả các Oligo được bảo quản trong nhiệt độ đông đá
- Thời gian khảo sát: 10 tuần
- Số lần lặp lại: 3
 Tiến hành thí nghiệm theo mỗi tuần và được kiểm tra bằng phương pháp PCR


5
0,5
1
1
1

(**: nồng độ DNA được nêu trong bảng 3.2)

• Tiến hành PCR, sử dụng nhiệt độ gắn mồi đã nêu trong bảng 3.2 trong 35 chu kỳ với
chu kỳ nhiệt như sau:


95 °C

95 °C

3 phút

30 giây

72 °C 72 °C
45 giây 5 phút
Ta
30 giây

25 °C
2 phút

Hình 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khảo sát mồi

chất nhuộm gen (PSA Mix Dye), dung dịch đệm TAE 1X (40 mM Tris

-

– acetate, 1 mM EDTA).
Hóa chất điều chỉnh pH: Trizma HCl, Trizma base
Hóa chất bảo quản và lưu trữ Primer: H2O khử ion (Bi.H2O), TE 1X.


3.4.1.3 Thiết bị
Bảng 3.6 Các thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
ST
T

Mục đích sử
dụng

Tên thiết bị

Model

Nơi sản
xuất

1

Luân nhiệt

Máy PCR


Đo nồng
DNA

6

Điện di
phẩm PCR

7

Cân khối lượng

Cân phân tích

8
Điều chỉnh pH
Máy đo pH
3.4.2 Các phần mềm sử dụng
-

–

Trung Quốc

Science California –
Mỹ

độ Máy đo nồng DeNovix DS – 11 FX
độ DNA
sản Bộ điện di