B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TH HI YN

BƯớC ĐầU ĐáNH GIá TáC DụNG CủA CRILIN T
LÊN Sự BIểU HIệN MộT Số GEN SINH UNG THƯ
Và ứC CHế UNG THƯ TRÊN MÔ HìNH CHUộT
NUDE
MANG Tế BàO UNG THƯ PHổI NGƯờI
Chuyờn ngnh : Y hc chc nng
Mó s

: 60720106

LUN VN THC S Y HC
Ngi hng dn khoa hc:
TS. Nguyn Vn ụ

H NI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Đô, là
người thầy, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, truyền
dạy nhiều kiến thức quý báu cũng những kinh nghiệm và các bài học ý nghĩa
về cuộc sống cho tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô, anh chị em và bạn

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2017
Người viết cam đoan

Nguyễn Thị Hải Yến


BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT
ADN
ARN
Bcl-2
Bcl-xl
FADD
TNHC
cADN
dNTP
PCR
RT-PCR

Acid Deoxyribonucleic
Acid Ribonucleic
B-cell lymphoma/leukemia-2
B – cell lymphoma – extra large
Fas-associated death domain

NSCLC

Complementary Deoxyribonucleic
Deoxyribonucleotid Triphotphat
Polymerase Chain Reaction

MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


8

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi là một trong những loại phổ biến nhất của ung thư trên
toàn thế giới và là nguyên nhân hàng đầu trong các tử vong do ung thư. Theo
dự đoán GLOBOCAN năm 2008, ung thư phổi là loại ung thư hàng đầu ở
nam giới, bao gồm 17% tổng số các trường hợp ung thư mới và 23% tổng số
ca tử vong do ung thư liên quan. Tỷ lệ tử vong đối với bệnh ung thư phổi ở
phụ nữ trong các nước đang phát triển chiếm 11% tổng số các ca tử vong do
ung thư ởphụ nữ, đứng thứ hai sau ung thư vú [1]. Đến nay, phẫu thuật, xạ trị
và hóa trị liệu là những chiến lược điều trị chủ yếu dành cho ung thư phổi.
Tuy nhiên, hiệu quả của các phương pháp điều trị bị hạn chế và có thể dẫn
đến một số tác dụng phụ. Trong thập kỷ qua, tỷ lệ tử vong do ung thư phổi
vẫn cao, với tỷ lệ sống 5 năm
chuột Nude mang tế bào ung thư phổi người.
2. Đánh giá sự biểu hiện mARN của gen Bax và Bak trên mô hình chuột
Nude mang tế bào ung thư phổi người.


10

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Những hiểu biết cơ bản về bệnh ung thư
1.1.1. Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào dưới tác động của một số tác nhân
gây ung thư làm tế bào tăng sinh vô hạn, không có tổ chức và không tuân theo
các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể. Người ta đã biết được có hơn
200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người [7].
1.1.2. Gen học và ung thư
Quá trình sinh bệnh ung thư liên quan chặt chẽ đến tổn thương 2 nhóm
gen, đó là gen sinh ung thư và gen ức chế ung thư. Bình thường hai nhóm gen
này có vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản, biệt hóa và chết
theo chương trình của tế bào, giúp cho sự ổn định sinh học của cơ thể.
1.1.2.1. Gen sinh ung thư (oncogene)
Năm 1911 Peyton Rous đã phát hiện ra virut sinh sarcom ở cơ gà và đến
những năm 60 người ta mới tìm thấy gen sinh u đó trong virut Rous và được
đặt tên là src. Sau đó hàng chục gen sinh u khác ở nhiều virut khác được phát
hiện. Giữa những năm 1970, các nhà vi sinh Mỹ John Michael Bishopvà
Harold Varmus thử nghiệm giả thuyết cho rằng các tế bào cơ thể khỏe mạnh
có chứa gen gây ung thư của virut không hoạt động, khi được kích hoạt sẽ gây
ung thư. Họ đã cho thấy rằng gen sinh ung thư được bắt nguồn từ gen tiền ung
thư (proto-oncogene) trong các tế bào cơ thể vật chủ của chúng. Ở người, gen
tiền ung thư có thể được chuyển đổi thành gen sinh ung thư bởi đột biến,

Các dạng đột biến của TP53 đã được liên quan đến hơn 50% của tất cả các
bệnh ung thư. Các đột biến trong hai gen ức chế khối u khác là BRCA1 và


12

BRCA2 trong ung thư vú, chúng được tìm thấy trong 5-10% của tất cả các
trường hợp và trong khoảng 85% của tất cả các trường hợp ung thư vú di
truyền [14].
1.1.3. Quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
Trong nhiều thập kỷ qua, những nghiên cứu cơ bản về ung thư đã cho thấy
sự tiến bộ đáng kể trong sự hiểu biết của chúng ta về sinh học ung thư và ung
thư di truyền. Trong số những điểm quan trọng nhất của những tiến bộ này là
sự nhận thức rằng quá trình chết tế bào theo chương trình và các gen kiểm
soát nó có ảnh hưởng sâu sắc đến kiểu hình ác tính [15].
Chết tế bào theo chương trình là một hiện tượng có tính di truyền của các
tế bào có nhân. Chết tế bào theo chương trình được Kerr, Wyllie và Curie mô
tả năm 1972 và đó là một hiện tượng phổ biến và cần thiết cho cuộc sống. Từ
sự phát triển bình thường của cơ thể, sự hằng định của các mô cho đến việc
loại trừ các tế bào bị viêm nhiễm hay sự dung nạp về miễn dịch học [16]. Nếu
hoạt động có sự thiếu hụt thì sẽ phát sinh ung thư và các dị tật trong cơ thể.
Ngược lại, hoạt động quá mức sẽ gây ra các biến đổi thoái hóa cơ và thần
kinh cũng như những rối loạn khác nữa. Chết tế bào theo chương trình có thể
được xem như một rào cản quan trọng để phát triển bệnh ung thư, chống lại
chết tế bào theo chương trình là một đặc tính của tế bào ung thư và là một
nguyên nhân chính của thất bại trong điều trị.
Quá trình chết tế bào theo chương trình diễn ra theo 2 con đường chính,
bao gồm con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết và con
đường nội sinh hay con đường qua trung gian ty thể.


chết tế bào theo chương trình) và caspase “khởi động” chưa hoạt động, tiền
caspase 9, trong một phức tạp multiprotein gọi là apoptosom. Điều này dẫn
đến việc kích hoạt các caspase 9, sau đó khởi phát một chuỗi các caspases
kích hoạt (caspases 3 và 7) dẫn đến những thay đổi về hình thái và sinh hóa
gắn liền với quá trình chết tế bào theo chương trình. Cơ chế điều hòa con
đường này rất tinh vi thông qua các hệ thống kích thích và ức chế phức tạp
mà hiện nay y học phân tử đang khám phá. Đây là một cơ chế bị chi phối bởi
2 nhóm protein: Một nhóm chống lại quá trình chết tế bào theo chương trình
như Bcl-2, Bcl-xl và Mcl-1 và một nhóm protein làm tăng hiệu ứng chết tế
bào theo chương trình như Bax và Bak. Ngoài ra còn có một số các protein có
liên quan như Bim, Bad, puma và noxa.
Chết tế bào theo chương trình giúp cho cơ thể loại bỏ những tế bào
không còn cần thiết, hoặc các tế bào bị tổn thương, sai hỏng có thể dẫn tới
ung thư [17], [18]. Do đó, các tác giả cho rằng sự tránh chết tế bào theo
chương trình là một điều kiện tất yếu cho sự thay đổi và tăng trưởng bền vững
của các tế bào ung thư đã được chấp nhận rộng rãi [19]. Có rất nhiều cách để


15

một tế bào ác tính có thể có được giảm quá trình chết hoặc chống lại chết tế
bào theo chương trình. Nhìn chung, cơ chế để tránhchết tế bào theo chương
trình bao gồm: Sự mất cân bằng của các protein chống chết tế bào theo
chương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình, sự giảm chức năng
caspase và sự giảm biểu hiện của các thụ thể chết.

Hình 1.2. Cơ chế tham gia tránh chết tế bào theo chương trình và ung thư
(Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12209154)
Do vậy, một sự hiểu biết chi tiết về cái chết của tế bào theo chương trình sẽ
giúp hiểu rõ hơn về sự phức tạp của khối u và cải tiến phương pháp điều trị ung

đến nay đều là tiền chết tế bào theo chương trình [22], [23], [24].


17

Hình 1.3. Các thành viên họ Bcl-2
(Nguồn: http://www.nature.com)
1.1.4.1. Gen Bcl-2
Bcl-2 là từ viết tắt của B-cell lymphoma/leukemia-2. Lần đầu tiên được
phát hiện ở nang lympho B. Đây là thành viên thứ hai của một loạt các protein
ban đầu được mô tả trong sự hoán vị NST bao gồm NST số 14 và 18 trong
nang lympho. Phần NST số 18 có chứa vị trí của Bcl-2 đã xảy ra hiện tượng
hoán vị với phần của NST số 14 có chứa kháng thể ở vị trí chuỗi nặng [25].

Hình 1.4. Sự chuyển vị của gen Bcl-2
(Nguồn:www.biology.com)


18

Bcl-2 có cấu trúc gồm một lõi kị nước bao quanh bởi một vỏ xoắn, có
trọng lượng phân tử là 27000 dalton. Nó được tạo nên từ 4 vùng BH (Bcl-2
homology) được đánh số từBH1-4. Các vùng BH được biết là rất quan trọng
trong chức năng của Bcl-2. Bcl-2 thường được tích hợp trong các màng ngoài
ty thể, nhưng cũng có thể có trong bào tương hoặc lưới nội chất.
Vaux cùng các cộng sự (1988) là những người đầu tiên báo cáo rằng
Bcl-2 có thể ức chế các tế bào chết. Sau kích thích chết tế bào theo chương
trình, các protein tiền apoptosis được hoạt hóa thông qua các sửa đổi sau tổng
hợp hoặc thông qua những biến đổi về cấu trúc của chúng. Bcl-2 tạo dị dimer
với các thành viên họ Bcl-2 tăng hiệu ứng chết tế bào theo chương trình, dẫn

đang gây tranh cãi [27]. Mặc dù Bcl-2 và Bcl-xl dường như không thể phân
biệt được chức năng, có bằng chứng rằng chúng khác nhau trong khả năng
của mình để bảo vệ tế bào khỏi tác nhân kích thích chết tế bào theo chương
trình khác nhau [28], [29].
Cấu trúc và ái tính liên kết của peptid Bak đột biến chỉ ra rằng nó thông
qua những chuỗi xoắn α amphipathic tương tác với Bcl-xl thông qua tương
tác kỵ nước và tĩnh điện. Đột biến trên toàn bộ chiều dài của Bak gây gián
đoạn mỗi tương tác, hạn chế khả năng Bak dị dimer hóa với Bcl-xl [30].
1.1.4.3. Gen Bax

Hình 1.5. Vị trí của gen Bax
Bax (BCL2-associated X) nằm trên NST 19, có kích thước 21 kDa. Bax
được mã hóa bởi sáu exon và được tạo nên từ ba vùng BH là BH1, BH2, BH3.


20

Bax được xác định là yếu tố kích thích chết tế bào theo chương trình đầu
tiên chống lại chức năng của Bcl-2. Vùng BH3 của Bax đã được chứng minh
là rất quan trọng trong việc hình thành dimer. Bax có thể hình thành đồng
dimers hoặc dị dimers với Bcl-2, Bcl-xl [31], [32]. Trong các tế bào động vật
có vú khỏe mạnh, phần lớn Bax được tìm thấy trong bào tương nhưng khi bắt
đầu các tín hiệu tự hủy hoại, Bax trải qua một sự thay đổi cấu tạo và chèn vào
các màng bào quan, chủ yếu là màng ngoài ty thể. Bax và Bak có thể hình
thành các lỗ trên màng ngoài ti thể và làm thay đổi tính thấm của nó. Điều này
dẫn đến sự ra đời của cytochrom c và các yếu tố tiền chết tế bào theo chương
trình khác từ các ty lạp thể, dẫn đến hoạt hóa caspase. Bax cũng có mặt trong
mạng lưới nội chất nơi mà chúng kiểm soát quá trình chết tế bào theo chương
trình thông qua các mức lưu trữ canxi.
Bax được kích hoạt bởi nhóm protein “chỉ có BH3”. Sự biểu lộ của Bax

(Nguồn: http://www.bloodjouARNl.org)


22

1.1.4.4. Các nghiên cứu về Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak trong ung thư
Một nghiên cứu trên 70 trường hợp dạ dày mạn tính, 49 trường hợp dị sản
ruột, 64 trường hợp loạn sản và 81 trường hợp ung thư biểu mô tuyến dạ dày
cho thấy: Tỷ lệ (+) của Bcl-2 và Bax cao nhất trong loạn sản vừa. Trong dị
sản ruột và loạn sản tỷ lệ (+) của Bcl-2 và Bax cao hơn trong viêm loét dạ dày
mạn tính và ung thư biểu mô tuyến dạ dày. Như vậy sự biểu lộ của Bcl-2 cũng
như Bax có thể có giá trị trong dự báo sớm bệnh ung thư dạ dày cũng như
trong những tổn thương tiền ung thư [35]. Trong khi Fulda và cộng sự đã báo
cáo rằng Bcl-2 biểu hiện quá mức dẫn đến ức chế chết tế bào theo chương
trình trong các tế bào ung thư biểu mô nguyên bào thần kinh, glioblastoma và
vú [36]. Ở bệnh nhân u lympho mạn tính, khi các tế bào này được nuôi cấy
trong ống nghiệm, chết tế bào theo chương trình do thuốc trong các tế bào
lympho B mạn tính tỷ lệ nghịch với tỷ lệ Bcl-2/Bax [24], [37]. Cùng với đó,
các nghiên cứu khác của Raffo và Mackey đã cho thấy biểu lộ quá mức của
Bcl-2, tế bào ung thư tuyến tiền liệt được bảo vệ trước kích thích chết tế bào
theo chương trình trong ống nghiệm [38] và tỷ lệ Bcl-2/Bax cao làm tăng
nguy cơ ung thư không đáp ứng với xạ trị vì vậy nghiên cứu này cho thấy giá
trị tiên lượng của tỉ lệ Bcl-2/Bax như một dấu ấn phân tử tiềm năng để dự
đoán khả năng đáp ứng với xạ trị của các khối u tuyến tiền liệt. Các nghiên
cứu khác đã cho thấy đánh giá của các trạng thái biểu hiện của Bcl-2 bởi khối
u có thể cung cấp thông tin tiên lượng về các biểu hiện lâm sàng của ung thư
phổi không phải tế bào nhỏ [39]. Kết luận này cũng phù hợp với các nghiên
cứu khác đánh giá giá trị tiên lượng của sự biểu lộ Bcl-2 [40], [41].
Nghiên cứu hồi cứu được thực hiện trên những bệnh nhân có khối u hắc tố
ác tính lan tỏa bề mặt (SSM, n = 44) hoặc khối u ác tính dạng nốt (n = 16) có

Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ thường gặp hơn ung thư phổi tế bào
nhỏ và nó thường phát triển và lan chậm hơn. Có ba loại ung thư không phải
tế bào nhỏ chủ yếu. Chúng được đặt tên theo týp tế bào từ đó ung thư phát


24

triển: Ung thư biểu mô tế bào vẩy (còn được gọi là ung thư biểu mô dạng biểu
bì), ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô tế bào lớn.
Ung thư phổi tế bào nhỏ ít gặp hơn ung thư phổi không phải tế bào nhỏ.
Loại ung thư này phát triển nhanh hơn và hay lan các bộ phận khác trong cơ thể.
 Những yếu tố nguy cơ của ung thư phổi
Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn thế
giới. Nguyên nhân gây ra ung thư phổi cho tới nay chưa được hiểu đầy đủ,
qua các tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy có một số yếu tố liên
quan đến nguy cơ phát triển bệnh này. Những yếu tố này bao gồm [44]:
Thuốc lá: Hút thuốc lá là nguyên nhân gây ung thư phổi hàng đầu. Các
chất có hại được gọi là tác nhân gây ung thư, có trong thuốc lá làm tổn hại tới
các tế bào ở trong phổi. Dần dần, những tế bào này có thể trở thành ung thư.
Khói thuốc lá đến nay là yếu tố nguy cơ chính và quan trọng nhất đối với
bệnh ung thư phổi. Nó gây ra hơn 80% của tất cả các ung thư phổi trên toàn
thế giới. Các chất độc hại trong khói thuốc làm tổn thương các tế bào phổi.
Theo thời gian, các tế bào bị tổn thương có thể trở thành ung thư. Đây là lí do
tại sao hút thuốc lá có thể gây ung thư phổi. Hít phải khói thuốc lá cũng có thể
gây ung thư phổi ở những người không hút thuốc. Một người tiếp xúc càng
nhiều với khói thuốc lá, nguy cơ bị ung thư phổi càng cao. Ngoài thuốc lá, xì
gà và thuốc lá tẩu cũng là một yếu tố nguy cơ. Số năm hút thuốc, số lượng xì
gà và thuốc lá tẩu hút mỗi ngày, mức độ hít khói thuốc đều ảnh hưởng đến
nguy cơ bị ung thư phổi.
Các yếu tố môi trường khác như khí radon, amiăng, ô nhiễm môi trường:

gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin,
Campuchia, Lào. Ở Vân Nam (Trung Quốc) lá được dung trị sang lở độc,
viêm tuyến vú, lở trĩ [46], [47].