ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG
MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM HƯƠNG
(LENTINULA EDODES) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG
MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM HƯƠNG
(LENTINULA EDODES) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8.44.01.18


công việc để em hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên,
cổ vũ, khích lệ tinh thần trong suốt thời gian qua.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện đề tài, song không
thể tránh những hạn chế và thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp của các thầy cô giáo và bạn bè đồng nghiệp.
Tác giả luận văn

Dương Thúy Quỳnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. a
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................... b
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................ d
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................... 3
1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc ............................... 3
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 3
1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR .. 4
1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 6
1.1.4. Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC ....................................... 8
1.2. Giới thiệu về nấm hương (Lentinula edodes) .................................... 10
1.3. Lentinan .............................................................................................. 11
1.3.1. Đặc điểm cấu tạo ............................................................................. 11
1.3.2. Hoạt tính và ứng dụng của Lentinan ............................................... 13
1.4. Phương pháp chiết tách Lentinan ....................................................... 16

sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography) ................. 40
3.3.5. Tổng hợp dữ liệu phổ của Lentinan (M2).............................................42
3.4. Phân tích xác định hàm lượng tổng Phenolic...........................................42
KẾT LUẬN .............................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CHỮ VIẾT TĂT
13

C- NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear
Magnetic Resonance)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic

H- NMR

Resonance)




DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Phổ hồng ngoại của 7 - hidroxy - 4- metylcoumarin .................. 3
Hình 1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat .......................... 5
Hình 1.3. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC .................................................... 8
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc Lentinan [13]..................................................... 12
Hình 1.5. Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử AFM ( Atomic force
microscope) và ảnh của Lentinan trong dung dịch 250C [32] 12
Hình 1.6. Mô hình phân tử xoắn kép ba theo chiều phải của β-glucan
(Lentinan) [29] ........................................................................ 12
Hình 1.7. Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit [24] ............................ 13
Hình 1.8. Cơ chế kháng u của Lentinan [32] ............................................ 14
Hình 2.1. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ
D-glucose................................................................................. 21
Hình 3.1. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ
D-glucose................................................................................. 25
Hình 3.2. Qui trình tạo mẫu Lentinan (giai đoạn 1).................................. 30
Hình 3.3. Qui trình tạo mẫu Lentinan (giai đoạn 2).................................. 31
Hình 3.4. Qui trình tạo mẫu Lentinan ....................................................... 32
Hình 3.5. Phổ IR của mẫu M2................................................................... 34
Hình 3.6. Phổ ESI-MS (negative-mode) của mẫu M2 chế độ MS/MS .... 34
Hình 3.7. Phổ LCMS-QTOF của mẫu Lentinan tiêu chuẩn từ nấm hương
[37] .......................................................................................... 35
Hình 3.8. Phân tử Lentinan dạng β-D-glucan polysaccharide với mảnh m/z
1151 tương ứng mắt xích C42H72O36 ....................................... 35
Hình 3.9. (A) Mảnh phân nhánh với liên kết β-D-1→6 glucosic và liên kết
β-D-1→3 glycosidic trong chuỗi chính của lentinan. Tương tác





DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Một số loại β-glucan[10] .......................................................... 13
Bảng 3.1. Kết quả lựa chọn dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan
ở giai đoạn 2 .................................................................................. 26
Bảng 3.2. Kết quả lựa chọn pH dung dịch đệm photphat trong quá trình tạo
mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 ........................................................... 28
Bảng 3.3. Tín hiệu 1H-NMR và

13

C-NMR của chất M2 ghi trong dung

môi D2O ......................................................................................... 38
Bảng 3.4. Tổng hợp dữ liệu phổ của Lentinan (M2).......................................41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỞ ĐẦU
Hiện nay, các phương pháp phổ không chỉ ứng dụng trong phạm vi ngành
hóa học mà còn ở nhiều ngành khác nhau như hóa sinh, y dược, nông nghiệp,
dầu khí, vật liệu, môi trường...Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp phổ
đã giúp cho việc nghiên cứu trong các ngành khoa học đặc biệt là hóa học các

nấm nuôi trồng, nấm men được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng phổ
biến trong các sản phẩm chống ung thư và sản phẩm tăng cường chức năng
miễn dịch. Hàng năm, lượng nấm hương sử dụng để sản xuất Lentinan ở Nhật
khoảng vài trăm ngàn tấn có giá trị lên tới trăm triệu USD, với qui trình tách
chiết công nghiệp cho ra sản phẩm Lentinan chất lượng cao phân bố trên toàn
thế giới [4,5]. Trong khi đó ở Việt Nam có nguồn nấm hương dồi dào, trồng rất
nhiều tại các tỉnh thành nhưng chủ yếu dùng làm thực phẩm, và xuất khẩu chưa
phát triển làm nấm dược liệu. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đề xuất đề tài:
“Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng, một số hợp chất có trong nấm
hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại” nhằm tách
chiết, tinh chế và phân tích cấu trúc những hợp chất thiên nhiên có trong nấm
hương, nâng cao giá trị của nấm hương.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại [1,2] được sử dụng để nhận biết các chất (kiểm tra độ tinh
khiết), để xác định các nhóm chức (phân tích cấu tạo), để định lượng hợp chất hữu
cơ và để nghiên cứu tác dụng tương hỗ nội phân tử và ngoại phân tử…
Để kiểm tra độ tinh khiết người ta đem so phổ đồ của chất với phổ đồ mẫu
có sẵn trong phổ đồ bản hoặc thư viện phổ (sử dụng phần mềm máy tính). Nói
chung để nhận biết một chất chưa biết bằng phương pháp phổ hồng ngoại, điều
quan trọng là phải biết giải thích phổ.
Trong trường hợp thông tin cấu trúc dự đoán chưa đủ tin cậy thì cần dựa

sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có
momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có
thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân
có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 .
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt
nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho
các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt
nhân 1H thì:    TMS  x .10 6 ( ppm)
o

Trong đó:νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa
một các tổng quát như sau:


 chuan  x
.10 6 ( ppm)
o

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân
mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh
hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong
phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng

biết số khối và cường độ của tín hiệu cho biết hàm lượng tương đối của ion
tương ứng.
a. Cơ sở lí thuyết
Như đã biết trong các phương pháp phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ cộng
hưởng từ hạt nhân người ta giữ nguyên phân tử để nghiên cứu thì ở phương pháp
phổ khối lượng người ta lại “phá hủy” phân tử để nghiên cứu chúng.
Trong phương pháp phổ khối lượng, trước tiên mẫu chất được làm bay
hơi, sau đó các phân tử bị bắn phá bởi chùm electron phóng ra từ catot của một
ống phóng điện với năng lượng cao và bị ion hóa.
Để có thể giải phóng ra được một electron ra khỏi phân tử, electron va
chạm phải có một động năng tối thiểu bằng năng lượng ion hóa của phân tử (715eV).
Giả sử phân tử (ABC) với A, B, C có thể là một nguyên tử hay nhóm
nguyên tử va chạm với các electron có năng lượng cao hơn năng lượng ion hóa,
đầu tiên xảy ra sự ion hóa phân tử [25]:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




(ABC) + 1e  (ABC)+ + 2e
(ABC) + e  (ABC)Z+ + (z+1)e
(ABC) + e  (ABC)-

(a)
(b)
(c)

Ở quá trình (a) sự va chạm với electron đã loại phân tử một electron. Vì
ở các phân tử hữu cơ các electron đều ghép đôi nên phân tử mất một electron
thì ion được tạo thành có một electron độc thân.

thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan
trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường.
Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký.
Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gia ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ
những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng
HPLC. Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân
tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích
sinh dược nói riêng.

Hình 1.3. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC
(1) Bình chứa pha động: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào
đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần
để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.
(2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các
bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi dẫn đến sai kết quả phân tích.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




(3) Bơm cao áp: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình
chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600 bar và tạo
dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10 ml/phút.
(4) Bộ phận tiêm mẫu: Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích
bơm có thể thay đồi.
(5)Cột sắc ký:Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều
dài cột thay đổi từ 5-25 cm đường kính trong 1-10 mm, hạt nhồi cỡ 0,35µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
(6) Đầu dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho
các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính
chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.Tín hiệu

Tên khoa học: Lentinula edodes
Đặc điểm phân loại[10,11]:
- Giới

: Fungi

- Họ

: Marasmiaceae

- Ngành : Basidiomycota

- Chi : Lentinula

- Lớp : Agaricomycetes

- Loài : L. edodes

- Bộ

: Agaricales

Hình dạng
Nấm hương có dạng như cái ô, đường kính 4-10 cm, màu nâu nhạt, khi
chín chuyển thành nâu sậm. Nấm hương có một chân đính vào giữa tai nấm.
Mặt trên tai nấm màu nâu, mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại.Trên mặt nấm
có những vảy nhỏ màu trắng. Thịt nấm màu trắng, cuống hình trụ. Nấm mọc
trên những cây có lá to và thay lá mỗi mùa như dẻ, sồi, phong[10,11].

Thành phần hóa học

Lentinan có cấu trúc điển hình của chuỗi xoắn kép ba [16,18,25,30].
Các (1,3)-β-D-glucan khác nhau bởi khối lượng phân tử, chiều dài mạch
chính, mức độ phân nhánh và chiều dài mạch nhánh.Kiểu cấu tạo mạch của các
(1,3)-β-D-glucan có sự phân biệt khá lớn theo nguồn gốc của chúng. (1,3)-β-Dglucan của nấm thường là một mạch phân nhánh dạng xương cá với mạch ngắn
nối vào mạch chính bằng dây nối 1→6 [12, 29].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Hình 1.4.Sơ đồ cấu trúc Lentinan[13]

Hình 1.5. Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử AFM ( Atomic force
microscope) và ảnh của Lentinan trong dung dịch 250C[32]

Hình 1.6. Mô hình phân tử xoắn kép ba theo chiều phải của β-glucan
(Lentinan)[29]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Các (1,3)-β-D-glucan của nấm men có cấu tạo tương tự của nấm nhưng
có mạch nhánh dài hơn [1].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan với liên kết (1,3/1,6) có hoạt
tính sinh học cao hơn β-glucan với liên kết (1,4/1,6) [12,18,19].

Hình 1.7. Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit [24]
Bảng 1.1. Một số loại β-glucan[10]
Liên kết

β-1,3 và β-1,6

được tách chiết từ Lentinula edodes
được

tách

chiết

từ

Pleurotus

ostreatus
Zymosan

β-1,3

1.3.2. Hoạt tính và ứng dụng của Lentinan
Hoạt tínhcủa Lentinan
Do Lentinan là một (1,3)/(1,6)-D-β-glucan nên nó mang hoạt tính của βglucan. Hoạt tính sinh học được chú ý nhiều nhất của (1,3)-β-D-glucan là tác
dụng trên hệ miễn dịch. Nó có tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu.
(1,3)-β-D-glucan có tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch ở các bạch cầu và các
tế bào biểu mô mà tác dụng chủ yếu là điều hòa sản xuất cytokine [12,32].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN





(1,3)-β-D-glucan có trong : nấm Phục linh (94%), nấm Linh chi, nấm
hương, nấm Tọa kê, nấm Múa, nấm men bia, cám lúa mạch(7%), yến mạch(5%),
lúa mạch đen (2%), lúa mì (