1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, tỷ lệ người mới mắc và tử vong do ung thư
có xu hướng ngày càng tăng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, nhất là ở các
nước nghèo, các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Theo Globocan
2012, trên thế giới hàng năm có có khoảng 14,1 triệu người mới mắc bệnh
ung thư và 8,2 triệu người tử vong do ung thư. Tại Việt Nam hằng năm có
khoảng 125000 trường hợp ung thư mới mắc và 97400 người tử vong do ung
thư, 5 loại ung thư hay gặp tính chung cho cả hai giới là ung thư gan, phổi, dạ
dày, vú, đại trực tràng [1]. Trong đó ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu trong
các tử vong do ung thư. Đến nay, phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu là những chiến
lược điều trị chủ yếu dành cho ung thư. Tuy nhiên, hiệu quả của các phương
pháp điều trị bị hạn chế và có thể dẫn đến một số tác dụng phụ. Trong thập kỷ
qua, tỷ lệ tử vong do ung thư phổi vẫn cao, với tỷ lệ sống 5 năm
1.1.1. Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào dưới tác động của một số tác nhân
gây ung thư làm tế bào tăng sinh vô hạn, không có tổ chức và không tuân theo
các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể. Người ta đã biết được có hơn
200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người [7].
1.1.2. Gen học và ung thư
Quá trình sinh bệnh ung thư liên quan chặt chẽ đến tổn thương 2 nhóm
gen, đó là gen sinh ung thư và gen ức chế ung thư. Bình thường hai nhóm gen
này có vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản, biệt hóa và chết
theo chương trình của tế bào, giúp cho sự ổn định sinh học của cơ thể.
1.1.2.1. Gen sinh ung thư (oncogene)
Năm 1911 Peyton Rous đã phát hiện ra virut sinh sarcom ở cơ gà và đến
những năm 60 người ta mới tìm thấy gen sinh u đó trong virut Rous và được
đặt tên là src. Sau đó hàng chục gen sinh u khác ở nhiều virut khác được phát
hiện. Giữa những năm 1970, các nhà vi sinh Mỹ John Michael Bishop và
Harold Varmus thử nghiệm giả thuyết cho rằng các tế bào cơ thể khỏe mạnh
có chứa gen gây ung thư của virut không hoạt động, khi được kích hoạt sẽ gây
ung thư. Họ đã cho thấy rằng gen sinh ung thư được bắt nguồn từ gen tiền ung
thư (proto-oncogene) trong các tế bào cơ thể vật chủ của chúng. Ở người, gen
tiền ung thư có thể được chuyển đổi thành gen sinh ung thư bởi đột biến,
khuếch đại gen và sắp xếp lại nhiễm sắc thể [8]. Người ta cho rằng đột biến ở
các gen này có thể là nguyên nhân làm mất khả năng khiểm soát quá trình
phân bào và do đó mà sinh u, chính đó là lí do tại sao lại có tên là oncogen
[9]. Có 3 giả thuyết cho việc hình thành oncogen [10].


4

- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng
trưởng (growth factor). Do rối loạn cơ chế điều hòa, yếu tố tăng trưởng hoạt

Trong nhiều thập kỷ qua, những nghiên cứu cơ bản về ung thư đã cho thấy
sự tiến bộ đáng kể trong sự hiểu biết của chúng ta về sinh học ung thư và ung
thư di truyền. Trong số những điểm quan trọng nhất của những tiến bộ này là
sự nhận thức rằng quá trình chết tế bào theo chương trình và các gen kiểm
soát nó có ảnh hưởng sâu sắc đến kiểu hình ác tính [15].
Chết tế bào theo chương trình là một hiện tượng có tính di truyền của các
tế bào có nhân. Chết tế bào theo chương trình được Kerr, Wyllie và Curie mô
tả năm 1972, đó là một hiện tượng phổ biến và cần thiết cho cuộc sống. Từ sự
phát triển bình thường của cơ thể, sự hằng định của các mô cho đến việc loại
trừ các tế bào bị viêm nhiễm hay sự dung nạp về miễn dịch học [16]. Nếu
hoạt động có sự thiếu hụt thì sẽ phát sinh ung thư và các dị tật trong cơ thể.
Ngược lại, hoạt động quá mức sẽ gây ra các biến đổi thoái hóa cơ và thần
kinh cũng như những rối loạn khác nữa. Chết tế bào theo chương trình có thể
được xem như một rào cản quan trọng để phát triển bệnh ung thư, chống lại
chết tế bào theo chương trình là một đặc tính của tế bào ung thư và là một
nguyên nhân chính của thất bại trong điều trị.
Quá trình chết tế bào theo chương trình diễn ra theo 2 con đường chính,
bao gồm con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết và con
đường nội sinh hay con đường qua trung gian ty thể [16].


6

Hình 1.1. Sơ đồ các con đường hoạt hóa chết tế bào theo chương trình
(Nguồn http://archive.impactaging.com/)
Con đường thông qua thụ thể chết (the death receptor pathway) hay con
đường ngoại sinh, khác với con đường của ty thể. Con đường này được khởi
động bởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăng
trưởng kích thích sự gắn của thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp thụ thể
TNF bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL-1 và 2) [17] với các phân

liên quan như Bim, Bad, puma và noxa [19], [20].
Chết tế bào theo chương trình giúp cho cơ thể loại bỏ những tế bào
không còn cần thiết, hoặc các tế bào bị tổn thương, sai hỏng có thể dẫn tới
ung thư [21], [22]. Do đó, các tác giả cho rằng sự tránh chết tế bào theo
chương trình là một điều kiện tất yếu cho sự thay đổi và tăng trưởng bền vững
của các tế bào ung thư đã được chấp nhận rộng rãi [23]. Có rất nhiều cách để


8

một tế bào ác tính có thể có được giảm quá trình chết hoặc chống lại chết tế
bào theo chương trình. Nhìn chung, cơ chế để tránh chết tế bào theo chương
trình bao gồm: Sự mất cân bằng của các protein chống chết tế bào theo
chương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình, sự giảm chức năng
caspase và sự giảm biểu hiện của các thụ thể chết.

Hình 1.2. Cơ chế tham gia tránh chết tế bào theo chương trình và ung thư
(Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12209154)
Do vậy, một sự hiểu biết chi tiết về cái chết của tế bào theo chương trình sẽ
giúp hiểu rõ hơn về sự phức tạp của khối u và cải tiến phương pháp điều trị ung
thư dựa trên sự hoạt hóa các thành phần của chết tế bào theo chương trình.


9

1.1.4. Một số gen liên quan
Gia đình gen Bcl-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chết tế
bào theo chương trình, đến nay được biết có 25 gen khác nhau. Hầu hết
chúng đều chứa một vùng vận chuyển màng đầu tận cùng C kỵ nước làm
nhiệm vụ neo chúng vào màng. Tuy nhiên, cũng có vài thành viên họ này

ban đầu được mô tả trong sự hoán vị NST bao gồm NST số 14 và 18 trong
nang lympho. Phần NST số 18 có chứa vị trí của Bcl-2 đã xảy ra hiện tượng
hoán vị với phần của NST số 14 có chứa kháng thể ở vị trí chuỗi nặng [30].


11

Hình 1.4. Sự chuyển vị của gen Bcl-2
(Nguồn:www.biology.com)
Bcl-2 có cấu trúc gồm một lõi kị nước bao quanh bởi một vỏ xoắn, có
trọng lượng phân tử là 27000 dalton. Nó được tạo nên từ 4 vùng BH (Bcl-2
homology) được đánh số từ BH1-4. Các vùng BH được biết là rất quan trọng
trong chức năng của Bcl-2. Bcl-2 thường được tích hợp trong các màng ngoài
ty thể, nhưng cũng có thể có trong bào tương hoặc lưới nội chất.
Vaux cùng các cộng sự (1988) là những người đầu tiên báo cáo rằng
Bcl-2 có thể ức chế các tế bào chết. Sau kích thích chết tế bào theo chương
trình, các protein tiền chết theo chương trình được hoạt hóa thông qua các sửa
đổi sau tổng hợp hoặc thông qua những biến đổi về cấu trúc của chúng. Bcl-2
tạo dị dimer với các thành viên họ Bcl-2 tăng hiệu ứng chết tế bào theo
chương trình, dẫn đến sự bất hoạt của chúng. Bax là một protein liên quan với
Bcl-2, thúc đẩy chết tế bào theo chương trình và là đích sao chép của hạ
nguồn của p53. Protein Bcl-2 dị dimer hóa với Bax do vậy mà ức chế chết tế
bào theo chương trình. Mặt khác Bax lại được kích thích bởi các thành viên
“chỉ có vùng BH3” trong khi Bcl-2 lại có tác dụng ức chế các gen này nên khi
Bcl-2 tăng biểu hiện thì các gen “chỉ có vùng BH3” bị ức chế, do vậy giảm


12

khả năng kích hoạt Bax. Hơn nữa, protein Bcl-2 lại có thể can thiệp vào

mã hóa bởi sáu exon và được tạo nên từ ba vùng BH là BH1, BH2 và BH3.
Bax được xác định là yếu tố kích thích chết tế bào theo chương trình đầu
tiên chống lại chức năng của Bcl-2. Vùng BH3 của Bax đã được chứng minh
là rất quan trọng trong việc hình thành dimer. Bax có thể hình thành đồng
dimer hoặc dị dimer với Bcl-2, Bcl-xl [36], [37]. Trong các tế bào động vật có
vú khỏe mạnh, phần lớn Bax được tìm thấy trong bào tương nhưng khi bắt
đầu các tín hiệu tự hủy hoại, Bax trải qua một sự thay đổi cấu tạo và chèn vào
các màng bào quan, chủ yếu là màng ngoài ty thể. Bax và Bak có thể hình
thành các lỗ trên màng ngoài ti thể và làm thay đổi tính thấm của nó. Điều này
dẫn đến sự ra đời của cytochrom c và các yếu tố tiền chết tế bào theo chương
trình khác từ các ty lạp thể, dẫn đến hoạt hóa caspase. Bax cũng có mặt trong
mạng lưới nội sinh chất nơi mà chúng kiểm soát quá trình chết tế bào theo
chương trình thông qua các mức lưu trữ canxi.
Bax được kích hoạt bởi nhóm protein “chỉ có BH3”. Sự biểu lộ của Bax
cũng được quy định bởi protein ức chế khối u p53 (TP53) và Bax đã được
chứng minh có liên quan trong quá trình chết tế bào theo chương trình được
điều hòa bởi p53. Các protein p53 là một yếu tố phiên mã, khi được kích hoạt
như là một phần của phản ứng của tế bào với stress, điều hòa rất nhiều gen
mục tiêu bao gồm Bax. Protein p53 tương tác với Bax thúc đẩy Bax kích hoạt
và chèn Bax vào màng ty thể [38].


14

1.1.4.4. Gen Bak

Hình 1.6. Cấu trúc của gen Bak
(Nguồn: http://atlasgeneticsoncology.org)
Bak nằm trên NST 6p21.31, là một tiền gen chết tế bào theo chương
trình thuộc họ protein Bcl-2. Ở tế bào khỏe mạnh Bak là một protein màng

lympho B mạn tính tỷ lệ nghịch với tỷ lệ Bcl-2/Bax [29], [43]. Cùng với đó,
các nghiên cứu khác của Raffo và Mackey đã cho thấy biểu lộ quá mức của
Bcl-2, tế bào ung thư tuyến tiền liệt được bảo vệ trước kích thích chết tế bào


16

theo chương trình trong ống nghiệm [44] và tỷ lệ Bcl-2/Bax cao làm tăng
nguy cơ ung thư không đáp ứng với xạ trị vì vậy nghiên cứu này cho thấy giá
trị tiên lượng của tỉ lệ Bcl-2/Bax như một dấu ấn phân tử tiềm năng để dự
đoán khả năng đáp ứng với xạ trị của các khối u tuyến tiền liệt. Các nghiên
cứu khác đã cho thấy đánh giá của các trạng thái biểu hiện của Bcl-2 bởi khối
u có thể cung cấp thông tin tiên lượng về các biểu hiện lâm sàng của ung thư
phổi không phải tế bào nhỏ [45]. Kết luận này cũng phù hợp với các nghiên
cứu khác đánh giá giá trị tiên lượng của sự biểu lộ Bcl-2 [46], [47].
Nghiên cứu hồi cứu được thực hiện trên những bệnh nhân có khối u hắc tố
ác tính lan tỏa bề mặt (SSM, n = 44) hoặc khối u ác tính dạng nốt (n = 16) có
độ dày 1,5-4 mm. Ba mươi bệnh nhân đã sống sót qua theo dõi 10 năm, trong
khi 30 bệnh nhân khác được phát triển di căn. Phần khối u đã được phân tích
bằng hóa mô miễn dịch cho sự biểu hiện của các chất điều hòa của chu kỳ tế
bào. Trong SSM, giảm Bax và Bak được tương quan với tiên lượng xấu: Tỉ lệ
Bax cao có liên quan đến tỷ lệ sống sót trong 10 năm, cụ thể: Bax cao tỉ lệ
sống sót trong 10 năm là 68%, trong khi Bax thấp chỉ có 26% sống sót, và
Bak cao tỉ lệ sống sót trong 10 năm là 62%, trong khi Bak thấp chỉ có 10%
sống sót. Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò đặc biệt của con đường chết tế
bào theo chương trình ty thể và các protein Bcl-2 liên quan cho sự tiến triển
khối u ác tính [48].
Trong nghiên cứu của Olopade, Bcl-xl được biểu hiện quá mức 18 trong
42 (43%) bệnh ung thư vú xâm lấn khi so sánh với biểu mô vú bình thường
liền kề. Phân tích protein bằng kỹ thuật Western blot với tám bệnh ung thư vú

chất có hại được gọi là tác nhân gây ung thư, có trong thuốc lá làm tổn hại tới
các tế bào ở trong phổi. Dần dần, những tế bào này có thể trở thành ung thư.
Khói thuốc lá đến nay là yếu tố nguy cơ chính và quan trọng nhất đối với
bệnh ung thư phổi. Nó gây ra hơn 80% của tất cả các ung thư phổi trên toàn
thế giới. Các chất độc hại trong khói thuốc làm tổn thương các tế bào phổi.
Theo thời gian, các tế bào bị tổn thương có thể trở thành ung thư. Đây là lí do
tại sao hút thuốc lá có thể gây ung thư phổi. Hít phải khói thuốc lá cũng có thể


18

gây ung thư phổi ở những người không hút thuốc. Một người tiếp xúc càng
nhiều với khói thuốc lá, nguy cơ bị ung thư phổi càng cao. Ngoài thuốc lá, xì
gà và thuốc lá tẩu cũng là một yếu tố nguy cơ. Số năm hút thuốc, số lượng xì
gà và thuốc lá tẩu hút mỗi ngày, mức độ hít khói thuốc đều ảnh hưởng đến
nguy cơ bị ung thư phổi.
Các yếu tố môi trường khác như khí radon, amiăng, ô nhiễm môi trường:
Khi làm việc trong môi trường có tiếp xúc với khí radon, amiăng và các chất
gây ung thư như asen, niken, crom, nhựa đường cũng có thể làm tăng nguy cơ
nguy cơ ung thư phổi phát triển, đặc biệt nếu là một người hút thuốc. Các nhà
nghiên cứu đã tìm ra mối liên hệ giữa bệnh nhân ung thư phổi và sự tiếp xúc
với một số chất gây ô nhiễm không khí nhất định, ví dụ như các sản phẩm phụ
sinh ra trong quá trình đốt dầu diesel và những nhiên liệu hóa thạch khác. Tuy
nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và vẫn đang
được tiếp tục nghiên cứu.
Các bệnh phổi và tiền sử bản thân: Một số bệnh phổi như bệnh lao, bệnh
phổi tắc nghẽn mạn tính làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư phổi. Bỏ hút thuốc
lá sau khi được chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư
phổi lần hai.
1.3. Tổng quan về trinh nữ hoàng cung

ở họng của bao hoa. Chỉ nhị mảnh và cong, dài 7-8 cm. Bao phấn mảnh, đính
lung, dài 1-2 cm. Bầu dưới, hình trụ đến hình trứng ngược, dài 1,2-1,8 cm, rộng
1-8 mm. Vòi nhụy mảnh, dài 19-20 cm, núm nhụy không rõ; phần đầu của vòi
nhụy và chỉ nhụy đều có màu đỏ tía [52], [53].


20

Hình 1.8. Cây trinh nữ hoàng cung
(Nguồn: http://caythuoc.org)
1.3.2. Các công trình nghiên cứu về Trinh nữ hoàng cung
Năm 1984 Ghosal (Ấn Độ) đã phân lập và xác định từ cánh hoa TNHC một
Gluco-ancaloid có tên là Latisolin. Thủy phân bằng enzym thu được aglycon có
tên Latisodin. Năm 1986 Ghosal còn công bố tách được một số dẫn chất
ancaloid có tác dụng chống ung thư crinafolin và crinafolidin từ TNHC. Năm
1989 ông còn chiết xuất từ dịch ép của cán hoa TNHC được 2 alcaloid mới có
nhân pyrrolophennanthridin là: 2-epilycorin và 2-epipancrassidin.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành
phần hóa học của cây náng có tên khoa học lá Crinum latifolium L. Nguyễn
Thị Ngọc Trâm và cộng sự (1991) đã nghiên cứu chi tiết về cây TNHC: Xác
định được 43 alcaloid trong lá cây TNHC sau khi ra hoa, 23 alcaloid trong lá
cây thời kỳ cây ra hoa, 10 alcaloid thời kỳ đầu của cây. Alcaloid Lycorin là
chất chính lấy từ Crinum Latifolium L, có tác dụng kích thích tế bào lympho
T trên in vitro và chuột thực nghiệm và làm giảm khả năng sống của các tế
bào u. Tách và làm sạch, xác định cấu trúc 2 chất: crinafolin, 1,2 beta epoxy
ambellin có tác dụng mạnh ở tế bào ung thư và hệ miễn dịch. Nước sắc
TNHC có tác dụng làm giảm khối u trên chuột thực nghiệm. Các thí nghiệm


21


22

thuốc bệnh viện [59]. Lê Anh Thư (2004), dùng viên nang Trinh nữ hoàng cung
điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt kết quả tốt là 96,1% giảm kích thước
tuyến tiền liệt, tăng lượng nước tiểu, giảm nhu cầu tiểu tiện [58].
Bệnh viện Phụ sản Trung Ương (2005) đã thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1
và 2 về tác dụng của viên nang Crila trong điều trị u xơ tử cung đã có kết luận:
Thuốc an toàn, không có tác dụng phụ, hiệu quả điều trị bệnh nhân có u xơ tử
cung là 65,6%, giảm các triệu chứng rong kinh, rong huyết do u xơ gây ra [60].
Viên nang Crilin T, một sản phẩm mới của cây Trinh nữ Crila (Crinum
latifolium L.var. Crilae Trâm vs Khanh, var.n) có chứa các alcaloid và các
flavonoid của cây Trinh nữ Crila. Crilin T có tác dụng tăng cường chức năng
miễn dịch chuyên nhiệm chống ung thư in vitro bởi làm tăng số lượng tế bào
Lympho T (đặc biệt là TCD8, TCD4) [5] và cũng làm tăng chế tiết các
cytokin IL-2 và TNFα in vitro của tế bào lympho người bình thường về lâm
sàng và của người bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn [6].
Sản phẩm này vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu và chưa được công bố.
1.4. Giới thiệu về mô hình nghiên cứu trên chuột BALB/c Nude
Chuột BALB/c Nude là chuột không có tuyến ức, trụi lông được mô tả
lần đầu tiên vào năm 1966 bởi Flanagan [61]. Một đột biến gen duy nhất đã
gây nên sự trụi lông vì vậy chúng thường được gọi là chuột “nude”. Ngoài ra,
đột biến này cũng gây ra sự thiếu hụt tuyến ức và dẫn đến hậu quả là sự suy
giảm miễn dịch do sự thiếu hụt trầm trọng lympho T, do vậy dòng chuột này
thường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học gồm các bệnh lý ung thư và
ghép các ung thư dị gen bằng cách cấy các tế bào ung thư của người để tạo
khối u và nghiên cứu in vivo với nhiều mục đích khác nhau.
Trên thế giới và tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu được
thực hiện trên mô hình chuột Nude [62], [63], [64] như công trình nghiên cứu
của Lin Song và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của HGC-MSC

+ Nhóm dự phòng: Nhóm được tiêm Crilin T với liều 80mg/kg cân
nặng/ngày x 7 ngày. Thời gian bắt đầu tiêm cùng ngày với tiêm tế bào ung thư
phổi người.
+ Nhóm điều trị: Nhóm được tiêm Crilin T với liều 80mg/kg cân
nặng/ngày x 7 ngày. Thời gian bắt đầu tiêm khi khối u đã phát triển đến kích
thước nhất định (20-270mm3).
- Tế bào dòng phổi người bình thường: Tế bào CRL-2079 được nuôi
cấy trong môi trường keratinocyte_SFM và các điều kiện cần thiết khác.


25

2.3. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu bệnh chứng, mô tả cắt ngang.
2.4. Vật liệuvà dụng cụ nghiên cứu
2.4.1. Vật liệu nghiên cứu
- Chuột
BALB/c nude, thiếu hụt miễn dịch, thuần chủng, không có tuyến ức,
không sản xuất được tế bào T, trụi lông, da bạch tạng. Chuột nude và thức ăn
nuôi chuột được mua từ Hoa Kỳ, chuột được nuôi trong điều kiện vô khuẩn
tại Học viện Quân y (có màng lọc khuẩn không khí phòng chuột và mọi thao
tác, dụng cụ, vật liệu xử dụng đều vô khuẩn).
- Thuốc
Viên nang Crilin T có hàm lượng 250mg do Công ty TNHH Thiên dược
cung cấp được dùng đường tiêm phúc mạc với nồng độ cao là 0.08mg/ml môi
trường nuôi cấy (tương ứng liều 80mg/kg cân nặng).
2.4.2. Dụng cụ nghiên cứu
- Máy PCR
- Máy điện di
- Máy chụp kết quả điện di