B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI
======

NGễ DIU HOA

NGHIÊN CứU ĐộT BIếN ở MộT Số VùNG TRọNG
ĐIểM
Và MứC Độ METHYL HóA GEN CDH1 ở BệNH
NHÂN
UNG THƯ Dạ DàY LAN TỏA DI TRUYềN
Chuyờn ngnh: Húa sinh
Mó s: 60720106
LUN VN THC S Y HC
Ngi hng dn khoa hc:
PGS.TS. NG TH NGC DUNG


HÀ NỘI - 2017
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình
của các thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Nhân d ịp này tôi xin
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học và Bộ môn Hoá sinh Trường Đại học Y Hà Nội.
Ban giám đốc Bệnh viện K Tân Triều, bệnh viện Đại học Y Hà Nội,
bệnh viện Việt Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Đặng Thị

được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của
cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết
này.

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2017
Tác gi ả

Ngô Di ệu Hoa



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT

CT

Chụp cắt lớp vi tính

H. pylori

Helicobacter pylori .

IARC

International Agency for Research on Cancer
(Tổ chức nghiên

cứu ung th ư quốc tế)

dày lan tỏa.....................................................................................14
1.3.4. Methyl hóa gen CDH1 được coi là cơ chế phân từ thứ 2 trong
UTDD lan tỏa di truyền................................................................17
1.3.5. Nghiên cứu trên thế giới về tăng cường methyl hóa vùng promoter
của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa.................................18
1.3.6. Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thư ở Việt Nam..............20
1.4. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến trên gen CDH1............20
1.4.1. Kỹ thuật PCR................................................................................20
1.4.2. Điện di kiểm tra sản phẩm.............................................................21
1.4.3. Kỹ thuật giải trình tự gen..............................................................22


1.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện tình trạng tăng cường methyl hóa
ở vùng promoter của gen CDH1:..........................................................23
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........26
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................26
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn......................................................................27
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ.........................................................................27
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................27
2.3. Thiết kế nghiên cứu..............................................................................27
2.4. Cỡ mẫu.................................................................................................27
2.5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................27
2.5.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi.....................................27
2.5.2. Tách chiết DNA tổng số từ mô......................................................28
2.5.3. Kỹ thuật PCR khuếch đại đột biến mầm gen CDH1.....................28
2.5.4. Kỹ thuật phân tích methyl hóa promoter gen CDH1....................29
2.5.5. Giải trình tự gen............................................................................32
2.6. Phương pháp phân tích số liệu.............................................................33
2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.........................................................33

Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA sau tách
chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân..............................................35
Bảng 3.3. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA sau tách
chiết từ mẫu mô của bệnh nhân......................................................40
Bảng 3.4. Kết quả khuyếch đại methyl và unmethyl của 25 mẫu tế bào ung
thư và 10 mẫu tế bào lành...............................................................45
Bảng 3.5. Tỷ lệ methyl hóa và unmethyl nhóm bệnh nhân nghiên cứu:.........45
Bảng 3.6. Tỷ lệ methyl hóa và unmethyl hóa gen CDH1 theo giới................46
Bảng 3.7. Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen
CDH1 trên vùng tế bào ung thư và vùng tế bào lành......................46
Bảng 4.1. Đặc điểm về tuổi khởi phát bệnh của nhóm nghiên cứu so sánh với
các nghiên cứu khác........................................................................48
Bảng 4.2. So sánh 3 phương pháp chính phân tích tình trạng methyl hóa ở
vùng promoter của gen....................................................................54


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phân loại ung thư dạ dày sớm ..........................................................6
Hình 1.2. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren.................................6
Hình 1.3. Hình ảnh vi thể chủ yếu là các tế bào nhẫn ở niêm mạc dạ dày ...........10
Hình 1.4. Vị trí của gen CDH1 .......................................................................11
Hình 1.5. Vị trí của E-cadherin và vai trò của nó trong kết dính tế bào – tế bào.....13
Hình 1.6. Con đường tín hiệu tế bào qua trung gian E-cadherin ....................14
Hình 1.7. Lược đồ của các gen đột biến dòng mầm CDH1............................14
Hình 1.8. Tình trạng methyl hóa promoter ở các bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền.....19
Hình 1.9. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR.................................................21
Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng SnuPE..................................................................23
Hình 3.1. Kết quả đo quang nồng độ DNA của bệnh nhân mã số B73...........35
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi exon 9 trên gel agarose 1.5%. ....36
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi exon 15 trên gel agarose 1.5%....37

kết dính ngoại bào E-cadherin, protein xuyên màng này có ch ức năng
như 1 chất ức chế ung thư, đóng vai trò quan trọng trong duy trì cấu trúc
biểu mô. Đột biến gen CDH1 ảnh hưởng cả phần trong và ngoài tế bào
của protein này, vì vậy dẫn đến rối loạn trong kết dính gi ữa các tế bào
biểu mô, tăng sự di động tế bào, tăng xâm lấn và di căn của tế bào ung
thư [8]. Phổ đột biến CDH1 hay gặp các đột biến điểm, mất đoạn, đ ảo
đoạn phân bố dọc theo toàn bộ chuỗi mã hóa trong 16 exon. Tuy nhiên,
theo nghiên cứu về phân bố đột biến gen CDH1, các đột biến gen này hay


2

gặp nhất trên exon 8, 9, exon 15 [9], [10], trong đó, ở Đông Nam Á
thường xảy ra trên exon 9 [11].
Đột biến CDH1 là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc th ể th ường,
tồn tại dưới dạng dị hợp tử, để trở thành UTDD lan tỏa di truy ền c ần có
1 cơ chế khác bất hoạt hoàn toàn cả 2 alen của gen này, đ ược g ọi là
“second hit”. Tăng cường methyl hóa đảo CpG ở vùng promoter của gen
CDH1 được coi là một trong những cơ chế như vậy trong UTDD lan tỏa
di truyền [12], [13], [14].
Vì vậy, việc nghiên cứu về tình trạng đột biến gen CDH1, mối liên
quan giữa tình trạng tăng cường methyl hóa ở vùng promoter của gen
CDH1 và đột biến CDH1 ở bệnh nhân UTDD lan tỏa di truy ền sẽ giúp tiên
lượng bệnh nhân, xây dựng chiến lược trong điều trị bệnh nhân ung th ư
dạ dày.
Trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên c ứu v ề đ ột biến gen CDH1
trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, tuy nhiên, ở Việt Nam hiện t ại
chưa có bất kì nghiên cứu nào về vấn đề này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu đột biến ở một số vùng trọng điểm và mức độ
methyl hóa gen CDH1 ở bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền”

người Việt Nam dưới 40 tuổi [19].


4

1.1.2. Các yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày:
UTDD là hậu quả của tương tác phức tạp giữa yếu tố v ật ch ủ v ới
môi trường, trong đó đáng lưu ý nhất là nhiễm Helicobacter pylori (H.
pylori).

1.1.2.1. Yếu tố môi trường
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nhóm nguy cơ môi trường quan tr ọng
nhất là chế độ ăn uống, hút thuốc và nhiễm Helicobacter Pylori (H.
pylori); ngoài ra còn có yếu tố tiền sử phẫu thuật cắt dạ dày và nội tiết
tố nữ.
Chế độ ăn uống: Chế độ ăn có vai trò quan trọng trong sự phát triển
của ung thư dạ dày. Nitrosamin có trong thức ăn hoặc do một số loại thức
ăn chứa nitrate tạo ra là một chất gây UTDD. Ăn ít rau và trái cây cũng làm
tăng nguy cơ UTDD [20].
Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 lần [21]. Nguy cơ
UTDD tăng theo thời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thu ốc [22].
Nhiễm H.pylori là một yếu tố nguy cơ mạnh của ung thư dạ dày và
được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp loại là tác nhân
ung thư nhóm I [23]. H. pylori có khả năng thích nghi đặc biệt để sống
trong môi trường acid ở dạ dày, sự cư trú của H. pylori gây nên viêm dạ
dày ở hầu hết đối tượng bị nhiễm vi khuẩn này. Sự bám dính của vi
khuẩn vào tế bào biểu mô gây nên đáp ứng viêm, với s ự tập trung c ủa
bạch cầu trung tính rồi sau đó là các tế bào lympho B và T, đại th ực bào
và tương bào, phần lớn đều sản sinh ra 1 lượng lớn các nhóm oxy ho ặc
nito phản ứng [24], những gốc tự do gây hư tổn tế bào biểu mô và sinh



6

Hiệp hội Ung thư Dạ dày Nhật Bản chia UTDD sớm thành 3 th ể
[30].


Type I (thể lồi): tổ chức ung thư lồi lên trên niêm mạc, có hình

nấm, hình giống polyp, chạm vào dễ chảy máu.


Type II (thể phẳng hay thể bề mặt): Gồm 3 phân type như

sau: IIa (phẳng gồ), IIb (phẳng dẹt), IIc (phẳng lõm)


Type III (dạng loét): tổn thương có độ sâu rõ rệt. Ung th ư dạng

loét thường nông, bờ gồ ghề, bẩn, niêm mạc quanh ổ loét không đều, các
nếp niêm mạc có thể tập trung, riêng rẽ hay cắt cụt.

Hình 1.1. Phân loại ung thư dạ dày sớm [30].
1.1.3.3. Vi thể
 Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Lauren
UTDD được Lauren chia thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là th ể
ruột và thể lan tỏa (Lauren,1926, được trích trong Leung, 2009,tr.264)
[26].



Thể lan tỏa (diffuse)


8

Thể hỗn hợp

Thể hỗn hợp ( không xác
định)

UTBM tuyến vảy
UTBM tế bào vảy
UTBM tế bào nhỏ
UTMB không biệt hóa
Các loại UTBM khác
1.1.4. Chẩn đoán UTDD
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Đa phần các triệu chứng lâm sàng của UTDD là không đặc hiệu và có
thể gặp trong nhiều bệnh lý khác. Trên thực tế, bệnh nhân khi có các triệu
chứng rõ ràng thì UTDD đã ở giai đoạn tiến triển.
Triệu chứng cơ năng có thể gặp: đau bụng thượng vị, sút cân, khó nuốt,
buồn nôn, nôn, xuất huyết tiêu hóa, thiếu máu,…
Triệu chứng thực thể: Thường xuất hiện muộn, sờ thấy khối u ở bụng,
hạch bạch huyết ở thượng đòn trái, quanh rốn, gan lớn khi UTDD đã di căn
[22].
1.1.4.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
Các phương pháp này có vai trò chủ yếu là đánh giá giai đoạn UTDD
trước khi quyết định liệu pháp điều trị.
Nội soi dạ dày: Nội soi dạ dày kết hợp với sinh thiết là biện pháp có độ

1.1.5.1. Điều trị


10

Phẫu thuật: Phẫu thuật cắt bỏ khối u được áp dụng đối với các bệnh
nhân khối u ở giai đoạn T1 đến T3, N1 hoặc N2 (giai đoạn I-III). Các kh ối
u dạ dày sớm có thể được điều trị bằng phương pháp cắt niêm mạc qua
nội soi hoặc phẫu tích dưới niêm mạc qua nội soi [26].
Xạ trị: UTDD tương đối đề kháng đối với xạ trị [26].
Hóa trị: Hóa trị liệu giữ vai trò khá quan trọng trong điều tr ị UTDD
nhằm giảm tỷ lệ tái phát sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm.
Điều trị đích: đây là một trong những tiến bộ mới nhất hiện nay
trong điều trị UTDD.
1.1.5.2. Tiên lượng của UTDD
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tiên lượng UTDD, gồm có: tổng
trạng, tuổi, giới tính, vị trí, kích thước, đặc điểm đại th ể, phân loại mô
bệnh học của khối u [33]. Tuy nhiên, quan trọng nhất vẫn là phân loại
giai đoạn theo TNM.
Ngày nay, bên cạnh các yếu tố lâm sàng, giải phẫu bệnh, nghiên cứu
những thay đổi về gen là hướng đi mới giúp điều trị, tiên lượng cho bệnh
nhân.
1.2. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
1.2.1. Định nghĩa
Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là bệnh do đột biến gen tr ội trên
nhiễm sắc thể thường; ung thư biểu mô tuyến kém biệt hóa, thâm
nhiễm thành dạ dày, làm mỏng thành dạ dày nhưng không hình thành
các khối riêng biệt [34].

1.2.2. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

trong quan hệ họ hàng bậc 1 hoặc bậc 2, với ít nhất một tr ường h ợp
chẩn đoán trước tuổi 50.
 Trong gia đình có từ ba trường hợp mắc UTDD th ể lan tỏa tỏa
trong quan hệ họ hàng bậc 1 hoặc bậc 2, không phụ thuộc vào tuổi phát
hiện bệnh.
 Bệnh nhân mắc ung thư dạ dày lan tỏa < 40 tuổi, chưa phát hiện
yếu tố gia đình.
 Bệnh nhân hoặc gia đình bệnh nhân có tiền sử bị ung th ư vú tiểu
thuỳ có ít nhất 1 trường hợp chẩn đoán tr ước 50 tuổi.
1.3. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền và đột biến gen CDH1
Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là hội chứng ung th ư bẩm sinh do
đột biến gen trội trên NST thường. Năm 1998, Guilford và cộng sự đã xác
định đột biến dòng mầm gen CDH1 là nguyên nhân gây nên UTDD lan t ỏa
di truyền [6].
1.3.1. Sơ lược về gen CDH1
 Cấu trúc gen CDH1
Trên bản đồ gen CDH1 nằm tại vị trí 16q22.1, gồm 16 exon tr ải dài
khoảng 100 kb DNA, khi phiên mã sẽ hình thành m ột mRNA 4,5 kb.

Hình 1.4. Vị trí của gen CDH1 [39].


13

 Chức năng gen CDH1
E-cadherin là một thành viên của gia đình Cadherin, các phân t ử đ ều
là các glycoprotein xuyên màng, là trung gian kết dính tế bào – tế bào
phụ thuộc vào canxi, đóng vai trò cơ bản trong việc duy trì s ự phân hóa
và kiến trúc bình thường của biểu mô [40]. E-cadherin cần có sự kết hợp
giữa phức hợp catenin- phức hợp actin trong khung x ương t ế bào trong



15

Hình 1.6. Con đường tín hiệu tế bào qua trung gian E-cadherin [46].
Các đột biến dòng mầm của gen CDH1
Đột biến xóa đoạn và sai nghĩa dẫn đến gây bất hoạt E- cadherin, đã
được xác định trong UTDD lan tỏa di truyền [47].

Hình 1.7. Lược đồ của các gen đột biến dòng mầm CDH1.
1.3.3. Nghiên cứu trên thế giới về đột biến gen CDH1 trong ung th ư
dạ dày lan tỏa.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về gen CDH1 trong UTDD
lan tỏa di truyền. Chúng tôi có lập bảng tóm tắt về tần số đột biến, ki ểu
đột biến gen CDH1 tổng hợp 34 tài liệu tham khảo khác nhau: