B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN THANH TNG

NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU
GEN
MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY
XƯƠNG
ĐốT SốNG ở PHụ Nữ MãN KINH

LUN VN THC S Y HC


H NI 2017
B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN THANH TNG

NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU
GEN
MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY
XƯƠNG
ĐốT SốNG ở PHụ Nữ MãN KINH

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, những
người thân đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Hà Nội, ngày

tháng
Học viên

năm 2017


Nguyễn Thanh Tùng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thanh Tùng, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 chuyên ngành
Sinh lý học, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Huy Bình, TS. Nguyễn Thị Thanh Hương.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Học viên


Forward primer

Hcy

Homocystein

MTHFR

Methylen Tetrahydrofolat Reductase

MĐX

Mật độ xương

Rw

Reverse wild type primer

Rm

Reverse mutation primer

SNP

Single nucleotide polymorphism


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1

2.3.1. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 3 năm 2017.
.........................................................................................................31
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu.......................................................................31
2.4. Quy trình nghiên cứu................................................................................31
2.5. Các phương pháp và công cụ thu thập số liệu.............................................32
2.5.1. Quy trình lấy máu và bảo quản.......................................................32
2.5.2. Đánh giá gãy xương đốt sống trên X Quang...................................33
2.6. Các bước tiến hành phân tích gen..............................................................33
2.6.1. Tách DNA.......................................................................................33
2.6.2. Qui trình xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR...............................33
2.6.3. Phương pháp giải trình tự gen.........................................................36
2.7. Các biến số nghiên cứu.............................................................................37
2.8. Phân tích và xử lý số liệu...........................................................................38
2.9. Đạo đức nghiên cứu..................................................................................38
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.........................................................39
3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu...........................................................39
3.1.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.....................................39
3.1.2. Đặc điểm mật độ xương của đối tượng nghiên cứu........................40
3.1.3. Đặc điểm gãy xương của đối tượng nghiên cứu.............................40
3.2. Xác định đa hình kiểu gen MTHFR C677T................................................42
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA..................................................................42
3.2.2. Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp
ARMS PCR.....................................................................................44


3.2.3. Kết quảxác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương phápgiải
trình tự gen......................................................................................45
3.2.4. Phân bố kiểu gen và tần số alen của đa hình MTHFR C677T của
đối tượng nghiên cứu......................................................................46
3.3. Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống của đối

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Giá trị tham chiếu thang định lượng trên người Việt Nam ..10
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO......................11
Bảng 1.3. Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) trong quần thể của phụ
nữ Việt Nam đo bằng máy Hologic.......................................................12
Bảng 1.4. Vị trí và các kiểu đa hình gen MTHFR.................................20
Bảng 1.5. Bảng phân bố tần số đa hình kiểu gen MTHFR C677T trên
thế giới...................................................................................................21
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR....................................................34
Bảng 2.2. Trình tự chuỗi DNA mồi........................................................35
Bảng 2.3. Các biến số nghiên cứu..........................................................37
Bảng 3.1.Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu............................39
Bảng 3.2. Đặc điểm mật độ xương của đối tượng nghiên cứu..............40
Bảng 3.3. Đặc điểm vị trí, hình thái gãy xương trên X-Quang của nhóm
bệnh nhân gãy xương.............................................................................41
Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA......................42
Bảng 3.5. Nồng độ DNA và độ tinh sạch trung bình.............................44
Bảng 3.6.Phân bố kiểu gen và tần số alen của đa hình C677T gen
MTHFR của đối tượng nghiên cứu........................................................46
Bảng 3.7. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật
độ xương cổ xương đùi của đối tượng nghiên cứu................................47
Bảng 3.8. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật
độ xương đầu trên xương đùi của đối tượng nghiên cứu.......................48
Bảng 3.9. Mốiliên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật
độ xương cột sống thắt lưng của đối tượng nghiên cứu.........................48
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới gãy


Tần số alen C và T của đa hình MTHFR C677T ở một số cộng đồng. .60

Biểu đồ 4.2. Sự phân bố kiểu gen của đa hình MTHFR C677T ở một số
cộng đồng..................................................................................61


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 1.3.
Hình 1.4.
Hình 1.5.
Hình 1.6.
Hình 1.7.
Hình 1.8.
Hình 1.9.
Hình 1.10.
Hình 1.11.
Hình 1.12.
Hình 1.13.
Hình 1.14.
Hình 1.15.

Hình 1.16.
Hình 2.1.
Hình 2.2.
Hình 2.3.
Hình 3.1.
Hình 3.2.

Quá trình chuyển hóa Homocystein..........................................69



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Gãy xương đốt sống là biểu hiện kinh điển của bệnh lý loãng xương
[1]. Tuy nhiên, đa số các trường hợp gãy xương đốt sống thường không có
triệu chứng, chỉ khoảng 30% các trường hợp được chẩn đoán ngẫu nhiên và
tới 70% các trường hợp không được phát hiện [2].
Kết quả từ các nghiên cứu dịch tễ ở người Âu Mỹ cho thấy, cứ 100
người sau độ tuổi 50 thì có khoảng 20 người bị gãy xương đốt sống. Ở phụ nữ
sau mãn kinh, tỷ lệ gãy xương đốt sống thay đổi từ 15% tới 25%, đồng thời có
sự khác biệt cao của tần suất gãy xương đốt sống giữa các quốc gia và các dân
tộc [3]. Tần suất gãy xương đốt sống gia tăng theo độ tuổi cũng ghi nhận được
ở cả hai giới, và nữ có xu hướng tăng nhiều hơn nam [3]. Khoảng 50% phụ nữ
bị gãy xương bị tử vong trong vòng 7 năm. Đối với các bệnh nhân may mắn
sống sót họ cũng mắc nhiều biến chứng và chất lượng cuộc sống bị giảm đáng
kể. Mỗi năm tại Châu Âu có khoảng 8,9 triệu ca gãy xương do loãng xương
và dẫn tới mất khoảng 5,8 triệu năm sống có chất lượng [4]. Gãy xương do
loãng xương gây tổn thất lớn cho nền kinh tế quốc gia. Ở châu Âu năm 2010
số tiền mà xã hội phải chi trả cho bệnh nhân loãng xương là 37 tỉ Euro [5]; ở
Mỹ mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca gãy xương tương đương với khoảng 17 tỉ
đô la.Theo ước tính thì một nửa số ca gãy xương sẽ xảy ra tại châu Á [6],
[7].Nghiên cứu dịch tễ gần đây tại Thái Lan và Trung Quốc cho thấy tần suất
gãy xương đốt sống ở phụ nữ sau mãn kinh tại các nước này là 10% và
30%[8], [9], [10]. Tại Việt Nam tỷ lệ gãy xương đốt sống ở nam là 23% và ở
nữ là 26% [1]. Điều này cho thấy gãy xương đốt sống là một gánh nặng y tế
của Việt Nam, nhất là trong điều kiện số người cao tuổi đang gia tăng nhanh.

kinh Việt Nam.
2. Xác định mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFRC677T với
mật độ xương và nguy cơ gãy xương đốt sống ở phụ nữ mãn kinh
Việt Nam.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về gãy xương đốt sống
1.1.1. Định nghĩa
Gãy xương do loãng xương là gãy xương do chấn thương nhẹ, gãy
xương do loãng xương là gãy vi cấu trúc.
Bệnh nhân bị loãng xương có nguy cơ cao đối với gãy xương đặc biệt
là đốt sống, gãy xương cổ tay và cổ xương đùi [16]. Gãy xương đốt sống là
hình thái phổ biến nhất và xuất hiện sớm nhất của gãy xương do loãng xương
ở phụ nữ mãn kinh và đang được xem là vấn đề sức khỏe toàn cầu, tuy nhiên
gãy xương đốt sống thường bị bỏ sót. Trên lâm sàng chỉ có 30% số ca gãy
xương đốt sống được chẩn đoán ngẫu nhiên, 70% còn lại thường không được
phát hiện [1].
Phụ nữ bị gãy xương đốt sống sẽ bị giảm tuổi thọ và tăng nguy cơ của
các gãy xương đốt sống, gãy xương đùi, và các gãy xương khác. Gãy xương
đốt sống thường đi kèm với đau lưng, hạn chế trong hoạt động hàng ngày và
giảm chất lượng sống [17].
Khoảng một nửa phụ nữ bị gãy xương tử vong trong vòng 7 năm. Đối
với các bệnh nhân may mắn sống sót họ cũng mắc nhiều biến chứng và chất
lượng cuộc sống bị giảm đáng kể [4].
Cơ chế sinh bệnh của gãy xương và xẹp đốt sống do loãng xương rất
phức tạp, có sự tham gia của nhiều yếu tố. Sự mất chất xương ở bè xương dẫn

lượng cuộc sống. Tỷ lệ tử vong do gãy xương ở phụ nữ là 50% đối với gãy cổ
xương đùi, 28% đối với gãy xương đốt sống và 22% do các gãy xương khác
[18].


5

1.1.3. Chẩn đoán gãy xương đốt sống do loãng xương
1.1.3.1. Tiêu chuẩn xác định gãy xương đốt sống trên X-Quang
Tiêu chí cho hình ảnh X Quang rõ nét
Kiểm tra gãy đốt sống do loãng xương chủ yếu dựa vào hình ảnh X
Quang, thường là X Quang thẳng và nghiêng cột sống lưng, thắt lưng. Xác
định mức độ gãy thì chỉ cần X Quang nghiêng là đủ. Khoảng cách từ tiêu
điểm phát bức xạ đến phim (focus-to-film distance-FFD) thường là 100 cm. X
Quang lưng tâm sẽ là T7, thắt lưng là L3 [20].
Hiện nay có hai phương pháp chính để chẩn đoán gãy xương đốt sống
trên X-Quang.
Thang bán định lượng Genant
Năm 1993, Genant và cộng sự đã thiết lập thang đo độ gãy xương đốt
sống bán định lượng. Phương pháp này đánh giá bằng cách quan sát chiều
cao, ước lượng sự giảm chiều cao và thay đổi hình dáng đốt sống [19].
Đốt sống được xác định là bị lún ép khi chiều cao bờ trước hoặc bờ
giữa nhỏ hơn chiều cao bờ sau của thân đốt sống từ 20% trở lên, hoặc chiều
cao của bờ sau thân đốt sống nhỏ hơn từ 20% trở lên so với chiều cao của
thân đốt sống kề cạnh. Nếu chỉ giảm chiều cao bờ giữa thân đốt sống gọi là
lún ép kiểu lõm hai mặt, nếu chiều cao cả bờ trước và bờ sau đều giảm so với
đốt sống kề cạnh thì gọi là lún xẹp đốt sống.


6


7

Hình 1.2. Thay đổi hình dáng đốt sống
(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)


8

Hình 1.3. Hình ảnh gãy nhẹ (các đốt đánh dấu sao)
(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)
Thang Genant dễ dàng xác định gãy vừa và nặng. Với gãy nhẹ có thể
căn cứ vào tiêu chí đĩa cùng của đốt đang xét không tiếp giáp, không song
song với đĩa cùng của đốt kế cận.
Một ưu điểm của Genant là mức độ nặng nhẹ không tỷ lệ với loại gãy
(bờ-nêm-wedge, lõm-đĩa-biconcavity hay nén-lún-crush).
Thang định lượng
Phương pháp này khắc phục được tính ước lượng của thang bán định
lượng. Chẩn đoán gãy xương đốt sống dựa vào bảng tham chiếu kích thước
đốt sống nữ giới của Hồ Phạm Thục Lan [1]. Phương pháp này tính cụ thể
chiều cao đốt sống trước (Ha), giữa (Hm) và sau (Hp) bằng cách đặt 6 điểm
trên phim, 3 điểm ở đĩa cùng trên và tương ứng với 3 điểm ở đĩa cùng dưới.
Tỷ số Ha/Hp và Hm/Hp được sử dụng để đánh giá gãy bờ đốt sống và gãy
đĩa, Hp(i)/Hp(i+1) và Hp(i)/Hp(i-1) để đánh giá độ lún. Chần đoán gãy xương


9

khi thay đổi bất kỳ một tỷ lệ chiều cao nào trên 3 lần độ lệch chuẩn. Khi có
bất kỳ một tỷ số nào của một thân đốt sống mà có -4SD
11

1.1.4.2.Chẩn đoán loãng xương
Từ năm 2002, các hội nghị quốc tế về loãng xương đã thống nhất
quan điểm về giá trị của các loại máy đo mật độ xương: máy đo mật độ xương
dùng siêu âm chỉ có giá trị tầm soát, chỉ có máy sử dụng tia X năng lượng
kép, được gọi là Dual Energy X-ray absorptiometry (DXA) mới có giá trị
chẩn đoán.
Nguyên tắc của phương pháp sử dụng tia X năng lượng kép là dùng tia
X có 2 mức năng lượng khác nhau quét qua một khối xương, máy sẽ đo độ
hấp thụ năng lượng tia X của xương và tính được mật độ xương (Bone
mineral density).
Sau khi đã đo BMD, người ta tính chỉ số T (T-score) là chỉ số BMD của
cá thể đó so với BMD tối đa của quần thể trẻ tuổi làm chuẩn. BMD tối đa phải
được ước tính từ một quần thể mang tính đại diện cao cho một dân tộc (vì
BMD khác biệt giữa các dân tộc). Chỉ số T được tính theo công thức sau đây:
- iBMD là mật độ xương của đối tượng i.
- pBMD là mật độ xương tối đa của quần thể trong độ tuổi 20-30 (còn
gọi là mật độ xương đỉnh – peak bone mineral density).
- SD là độ lệch chuẩn của BMD trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30.
Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương theo WHO như sau: [21]
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO
T-score
Chẩn đoán
Chỉ số T cao hơn -1
Bình thường
Chỉ số T trong khoảng -2,5 đến -1,0
Thiếu xương
Chỉ số T thấp hơn hoặc bằng -2,5
Loãng xương