BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS
ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1411100668

: Quách Hồng Thúy
Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2018


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý
thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai. Các
số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

2


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

i


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài…………………………………………………….. 1

2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………… 1
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu……………………………………………….. 2
4. Ý nghĩa đề tài khoa học………………………………………………………….. 2
5. Các kết quả đạt được của đề tài…………………………………………………...3
6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:……………………………………………………. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………. 4
1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp………………………………………………. 4
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu……………………………………………………………. 4
1.1.2 Phân loại……………………………………………………………………… 5
1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên………………………………. 5
1.1.4 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 6
1.1.5 Đặc điểm sinh hóa…………………………………………………………….. 6
1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử…………………………………….. 8

ii


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.6 Khả năng sinh IAA……………………………………………………………... 39
1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA……………………………………………………… 40
1.6.2 Khái niệm…………………………………………………………………….. 41
1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)…………………. 42
1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)……… 44
1.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus spp. ứng dụng vào sản xuất nông
nghiệp………………………………………………………………………………..45
1.7.1 Nghiên cứu nước ngoài……………………………………………………….. 45
1.7.2 Nghiên cứu trong nước……………………………………………………….. 46
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 48
2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………. 48
2.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………………... 48
2.2.1 Vật liệu……………………………………………………………………….. 48
2.2.2 Hóa chất………………………………………………………………………. 48
2.2.3 Môi trường……………………………………………………………………. 49
2.3.Thiết bị và dụng cụ……………………………………………………………... 50
2.3.1 Thiết bị……………………………………………………………………….. 50
2.3.2 Dụng cụ………………………………………………………………………. 51
2.4 Bố trí thí nghiệm………………………………………………………………... 52
2.5 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………….. .54

iii


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

3.3 Khả năng đối kháng nấm của các chủng……………………………………….. 95
3.3.1. Khả năng đối kháng nấm Fusarium sp……………………………………… 95
3.3.2. Khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh
long…………………………………………………………………………………..97
3.4. Khả năng phân giải lân khó tan của các chủng………………………………… 100
3.5 Khả năng sinh IAA của các chủng……………………………………………… 102
3.9 Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng vi khuẩn đối với thanh long ứng
dụng bảo quản sau thu hoạch……………………………………………………… 105
3.10 Kết quả hiệu quả đối kháng nấm Fusarium sp. gây chết cây ớt………………. 110
3.11 Định danh các chủng có triển vọng…………………………………………… 117
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………….. 120
4.1. Kết luận …………………………………………………………………………120
4.2. Kiến nghị……………………………………………………………………….. 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………….

122

PHỤ LỤC…………………………………………………………………………

1

v


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
NB: Môi trường Nutrient Broth
NA: Môi trường Nutrient Agar
NMSL: Nước muối sinh lý

Hình 3.5: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Fusarium sp.của các chủng Bacillus spp.

vii


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum của các chủng
Bacillus spp.
Hình 3.7: Hàm lượng photphat khó tan do các chủng Bacillus sp.p. phân giải (Trong đó
A: thí nghiệm; B: đối chứng)
Hinh 3.8: Lượng photphat các chủng Bacillus spp. phân giải theo thời gian
Hình 3.9: Khả năng sinh IAA c ủa các chủng vi khuẩn. (Trong đó A: Bổ sung
tryptophan, B: là không bổ sung tryptophan)
Hình 3.10: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp.
Hình 3.11: Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 7 ngày
Hình 3.13: Chiều cao cây qua các nghiệm thức
Hình 3.14: Chiều dài rễ qua các nghiệm thức
Hình 3.15: Số lá qua từng nghiệm thức
Hình 3.16: Kết quả giải trình tự gen 16S của mẫu BPS6
Hình 3.17: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BPS6
Hình 3.18: Kết quả giải trình tự 16S của chủng BTA7
Hình 3.19: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BTA7

viii


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

DANH MỤC BẢNG

đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh có thể bảo vệ cây trồng, chống lại các vi sinh
vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt
(Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017). Do đó, nhiều
chủng Bacillus đã được sản xuất thành chế phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt
Nam, việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo phân bón vi sinh đã được quan tâm và
triển khai (Phạm Văn Toản, 2002). Tuy nhiên, việc sử dụng Bacillus để trừ bệnh hại
vẫn còn khá hạn chế, chủ yếu là nhập chế phẩm từ nước ngoài. Mặt khác, hiệu lực đối
kháng bệnh của các chủng Bacillus vẫn khá biến động. Xuất phát từ những lý do trên,
sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong
sản xuất nông nghiệp.”
2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tổng hợp tài liệu:
+ Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến
đề tài.
+ Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.

1


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

- Phương pháp nghiên cứu:
+ Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào và tuyển chọn các
chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ các nguồn đất.
+ Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các chủng
Bacillus spp. để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có nguy cơ gây
bệnh.
+ Bố trí các thí nghiệm khảo sát tương ứng từng thí nghiệm
- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.

- Phần Mở đầu.
- Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan
đến tài liệu nghiên cứu.
-Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến các
dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
-Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài
thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.
-Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề
nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

3


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp.
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới
kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó, một số nơi gọi là
khuẩn que hoặc trực khuẩn.
Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa và in nghiêng) là tên của một chi gồm các vi khuẩn
hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicutes.
Chi Bacillus được đặt tên vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg, có chứa
vi khuẩn hình que (trực khuẩn). Ông đã có bảy năm trước đó được đặt tên là chi
Bacterium. Bacillus sau đó đã được Ferdinand Cohn sửa đổi để mô tả thêm chúng như
là bào tử hình thành bào tử, vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc vi khuẩn kỵ khí.
Giống như các chi khác liên quan đến lịch sử vi sinh vật như Pseudomonas và Vibrio,
267 loài Bacillus có mặt khắp nơi. Chi này có sự đa dạng 16S ribosome rất lớn và đa
dạng về môi trường.

được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 6– 10 7 triệu
cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất
hiếm.
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi
một số loài khác như Bacillus haericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae,
Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi
trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)
theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita (2007).

5


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.1.4 Đặc điểm hình thái học

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo
Malarkodi Chelladurai et al (2013)
Bacillus spp. là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase dương
tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Các chủng
Bacillus spp. có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển
nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5-0,8µm × 1,8-3
µm. Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus spp. sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện
bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus spp. sẽ nảy mầm và phát triển như
một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục, kích
thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần
tâm nhưng không chính tâm theo Hong et al (2009).
1.1.5 Đặc điểm sinh hóa
Bacillus spp. có một số test sinh hóa đặc trưng sau: Lên men nhưng không sinh hơi

Citrate

+

Nitrate

+

Gelatin

+

Di động

+

Amylase

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose


trì cấu trúc của vách tế bào theo McKenney et al(2013).
1.1.6.2 Cấu tạo bào tử
Bacillus spp. sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang của tế
bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử. Bào tử là một cấu
trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của
quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào
phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả năng
tạo bào tử là Bacillus và Clostridium. Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp bào
tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp
vỏ của tế bào mẹ, ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein
mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng c ủa bào tử. Vỏ của
bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide
và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu
trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt theo McKenney
et al (2013).
1.1.6.3 Đặc điểm của bào tử

8


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bào tử ở Bacillus spp. không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là
dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn
điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện
khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong
xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ
250 triệu năm đến nay vẫn còn sống theo Hong et al (2009). Nhiệt độ 1000C, bào tử
của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 - 20 giờ. Ngoài việc chịu được
nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại

lai để thực hiện quá trình biến nạp.
Sức đề kháng của bào tử
Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia cực
tím, áp suất và chất sát trùng.
Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố:
Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến
tính protein khi tăng nhiệt độ.
Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2 + và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp
với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính ổn định cao đối với nhiệt độ.
Các enzyme và các ho ạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng
không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.
Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các
chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp.
Bacillus spp. là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh hại cây
trồng. Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng,

10


Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

không gây hại cho con người và cây trồng. Mặt khác, có thể phân hủy các thành phần
thực vật già cõi, hệ sợi nấm đã chết của các loài nấm khác nhau thành các hợp chất hữu
cơ nhỏ hơn, theo thời gian tạo thành lớp mùn cho đất (Markovich và Kononova, 2003;
Narasimhan và Shivakumar, 2012). Vi khuẩn Bacillus subtilis nằm trong nhóm vi
khuẩn có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cho cây. Trong các vi sinh vật
đối kháng, vi khuẩn Bacillus được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại
nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và một số vi
khuẩn khác nhờ vào khả năng sinh ra các chất kháng sinh (Lê Đức Mạnh và cộng sự,

cho cây trồng tăng khả năng kháng bệnh.
* Tiết kháng sinh:
- Chi vi khuẩn Bacillus tiết các loại kháng sinh kanosamine (Milner et al., 1996),
bacillomycin (Volpo n et al., 1999), iturin A2 (Yoshida et al., 2002), prodigrosin và (+)(S)- dihydroaeruginoic acid (Carmi et al., 1994; Nguyễn Thị Thu Nga, 2003). Theo
Carmi et al. (1994) thì DAPG, PRN, PLT và (+)-(S) dihydroaeruginoic acid có khả
năng hạn chế các nấm gây bệnh cây như Sclerotium rolfsii, Colletotrichum
gloeosp.orioides và Rhizoctonia solani. Trong các loại kháng sinh trên, DAPG và
PRN được phát hiện khá nhiều ở các chi vi khuẩn đối kháng. Có loại kháng sinh có phổ
ức chế rộng như DAPG, nó có thể ức chế được cả nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây hại
(Nguyễn Thị Thu Nga, 2003).
Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin,
The Prokaryotes, 2006)

Loài

TÁC DỤNG CỦA CÁC LOẠI KHÁNG SINH
Đối kháng Ức
vi

chế Kháng

khuẩn quá trình phổ rộng

Gram

tạo sợi

sinh Đối
nấm