iLỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường đại học Nha Trang đã tạo một môi
trường học tập và cơ hội quý báu cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo của Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện (Công nghệ
sinh học và môi trường) đã tận tình dìu dắt, dạy bảo tôi trong suốt khóa học 2006 – 2010.
Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
TS. Nguyễn Văn Duy, người thầy đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn chính cho
tôi.
Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và môi trường, đã tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện khóa luận tại trường.
Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã
nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại phòng thí
nghiệm.
Các bạn trong nhóm sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh
học của khóa 48, 49, 50 Viện Công nghệ sinh học và môi trường, đã giúp đỡ nhiều cho tôi.
Các bạn lớp 48 CNSH, phòng 304.K5 – những người bạn đồng hành luôn bên cạnh và giúp
đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!
Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết ơn vô
hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi.
Nha Trang, 25/6/2010
Sinh viên Dư Thị Lưu Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus kháng Vibrio trên tôm nuôi 13
1.3.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài 13
1.3.2. Những nghiên cứu ở trong nước 14
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Vật liệu 16
2.1.1. Mẫu tôm sú 16
2.1.2. Môi trường 16
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng: 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu 17
2.2.1. Phân lập Bacillus 17
2.2.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Bacillus 17
2.2.3. Phân lập Vibrio 18
2.2.4. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Vibrio 18
2.2.5. Tuyển chọn các chủng Bacillus kháng Vibrio 18
2.2.6. Nhuộm Gram 19
PHỤ LỤC
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
iv
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT Kí hiệu Chữ viết tắt
1 APW
Nước peptone kiềm
2 BOD Biochemical oxygen demand
3 CFU
Colony forming unit
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
o
C 31
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng
Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn
(D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37
o
C 23
Hình 2. Khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio (V 1.1, V 1.3, V 2.1, V 2.4, V 3.1 và
V 3.3) của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính
vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37
o
C 25
Hình 3. Hoạt tính kháng Vibrio V 1.3 của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7
và B 3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37
o
C 27
Hình 4. Vòng kháng Vibrio V 1.1 của 4 chủng Bacillus lựa chọn sau 24h nuôi
cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30
o
C 27
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
1
MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản được phát triển rất mạnh ở các nước châu Á, Mỹ La tinh và
Đông Nam Á. Ở Việt Nam, năm 2002 chính phủ quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu
tiên, trong đó ngành nuôi tôm là ngành mũi nhọn, nhằm mục đích: tăng kim ngạch xuất
khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao hiệu quả sử dụng
đất và tạo công ăn việc làm cho người lao động. Năm 2002, Việt Nam đã xuất khẩu trên 2
tỷ USD từ sản phẩm thủy sản, trong đó tôm chiếm 50%, đứng hàng thứ 5 trên thế giới, và
đang phấn đấu đạt 4,5 – 5 tỷ USD vào năm 2010. Năm 2004 sản lượng nuôi trồng thủy sản
đạt mức 1,4 triệu tấn/năm, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản. Diện tích nuôi trồng thủy
sản mỗi năm một tăng, tính đến năm 2005 đạt 750 nghìn ha (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên
Thành, 2007).
Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác được nuôi
để lấy thực phẩm. P. monodon là loài tôm được nuôi rộng rãi nhất trên thế giới. Hàng năm
hơn 900.000 tấn tôm sú được tiêu thụ, hai phần ba số đó đến từ các trại tôm ở Đông Nam
Á.
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), năm 2009 tôm
là mặt hàng thủy sản xuất khẩu duy nhất tăng cả về lượng và giá trị so với năm 2008 và
đưa ra dự báo: năm 2010, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực, kim ngạch dự kiến sẽ
đạt 1,4 tỉ USD.
Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở
nhiều cơ sở nuôi trồng. Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch
bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Vấn đề ô nhiễm nước ao nuôi là do lượng thức ăn
thừa tôm không sử dụng được lớn, tôm bài tiết, lột xác nhiều và xác của những động vật
Tuyển chọn các chủng Bacillus đối kháng Vibrio gây bệnh trên tôm sú
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Bacillus lựa chọn
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Vibrio
1.1.1. Đặc điểm sinh học của Vibrio
Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn có dạng hình que hay hình dấu
phẩy, kích thước tế bào 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Vibrio không hình thành bào tử và có khả
năng chuyển động nhờ một tiên mao hay nhiều tiên mao mảnh (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
3
Là các vi khuẩn bắt màu Gram âm, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase
dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H
2
S (Trần Linh Thước,
2008). Hầu hết các loài của chi Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp
ở 20 – 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa
cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc biệt giáp xác nuôi ven biển và trên biển. Môi
trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp
Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio được chia làm 2 nhóm:
nhóm có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; nhóm không có khả
năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu xanh lá cây. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng
cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 – 30
o
C (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
đáng kể đạt 120,7 triệu tấn năm 1995. Nếu tính từ năm 1989 sản lượng gia tăng hàng năm
khoảng 15,6 triệu tấn. Hầu hết sản lượng gia tăng đến từ nuôi trồng thủy sản (FAO, 1997).
Riêng đối với nghề nuôi tôm, từ năm 1984 đến năm 1995 sản lượng tăng hàng năm
khoảng 16,8%, trong đó chủ yếu là nghề nuôi tôm sú (sản lượng tôm sú nuôi trong năm
1995 chiếm khoảng 96,3% tổng sản lượng tôm nuôi).
Tuy nhiên từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các
nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do
dịch bệnh (FAO, 1997). Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới
giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996
và đến năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn (World Shrimp Farming, 1997). Tại Việt Nam trong
hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh
ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994).
Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng Sông Cửu Long cho thấy
các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn vibrios và các virus quan trọng như
MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo
và cs, 1997). Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính
nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987). Vấn đề này dường như khá phổ biến ở
các nước châu Á, nơi mà việc nuôi tôm được xem là hoạt động chính yếu. Dựa vào khoảng
49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi khuẩn gây bệnh
là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium leiognathi.
Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi
khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa
sông và vùng nước lợ (Sodthongkong, 1996). Điều này được chứng minh từ kết quả phân
lập vi khuẩn từ các mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao
nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Sae-Oui và cs, 1987; Songsrem và cs,
1990; Ruangpan và cs, 1997). Chất thải từ hệ thống tiêu hóa, trứng của tôm mẹ được nghi
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
5
động vật thủy sản do Vibrio gây ra như sau:
Bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
6
Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều
quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường
bị bệnh này. Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ
nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu.
Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ
của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở
các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã
phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus,
và V. anguillarum (Phan Thị Vân và cs, 2000). Ngoài ra có những thông báo khác
về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V. anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm
khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị Hòa
và cs, 2004).
Bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác
Bệnh này còn có thể có các tên gọi khác: bệnh vỏ, bệnh đốm nâu, đốm đen,
bệnh hoại tử phụ bộ. Ở cua biển khi bị bệnh này gọi là bệnh rỉ sắt, bệnh hoa mai.
Giáp xác khi bị bệnh này thường có một số dấu hiệu sau: xuất hiện các vùng mềm
trên vỏ kitin, sau đó tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng, tại đó vỏ kitin bị ăn mòn,
các phần phụ (chân bò, chân bơi, râu…) và đuôi tôm có thể phồng lên rồi mòn cụt
dần. Sắc tố Melanin bị khuếch đại, sự mờ đục của đốt bụng thứ 6 và xuất hiện sắc tố
đen nâu trên mô gan tụy. Bệnh này có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau: tôm
mẹ, tôm thịt, ấu trùng và hậu ấu trùng trong các trại giống. Cũng có trường hợp
bệnh xảy ra kèm theo một số dấu hiệu khác trong các ao nuôi tôm như: tôm bị bệnh
thường bẩn mình, bẩn mang, có màu hồng đỏ trên cơ thể, yếu, bỏ ăn rồi chết. Có
nhiều loại Vibrio được phân lập từ bệnh này: Vibrio alginoliticus. V.
sát trùng bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp cơ học (lọc), phương pháp hóa
học (xử lý bằng thuốc sát trùng), phương pháp lý học (sát trùng bằng đèn cực tím), phương
pháp sinh học, phương pháp sinh thái để tiêu diệt và kìm hãm sự phát triển của
Vibrio…(Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
Độ mặn và nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển mạnh. Vì vậy
cần giảm độ mặn trong ao nuôi tôm thịt xuống 15 - 20‰ để kìm hãm sự phát triển của
Vibrio (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004). Vào mùa hè nhiệt độ thường cao, để hạn chế khả năng
tăng nhiệt cần duy trì mức nước trong ao nuôi đạt độ sâu từ 1,2 - 1,5m.
Ô nhiễm môi trường trong quá trình nuôi do lượng thức ăn dư thừa và do đông vật
thủy sản thải ra là yếu tố nguy hiểm dẫn đến phát sinh dịch bệnh. Cần xifon đáy và lọc
nước để loại bỏ các chất hữu cơ lắng đáy và lơ lửng trong bể ấp và thay nước đáy trong ao
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
8
thâm canh. Cần lựa chọn thức ăn có chất lượng tốt, xác định khẩu phần thức ăn chính xác,
tránh dư thừa. Với thức ăn tươi sống cần được sát trùng bằng một số thuốc diệt khuẩn
(formalin, iodine) rồi rửa lại bằng nước sạch trước khi cho ấu trùng ăn. Có thể dùng chế
phẩm vi sinh (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống nuôi và giảm lượng chất thải
hữu cơ trong ao, bể, kìm hãm sự phát triển của Vibrio gây bệnh. Không dùng kháng sinh
(antibiotic) để phòng bệnh, có thể dùng chất khử trùng (formol, BKC…) để diệt khuẩn
ngoài môi trường, nhưng phải lựa chọn nồng độ thuốc không ảnh hưởng tới vật nuôi và chỉ
dùng khi thật sự cần thiết, coi đó chỉ là giải pháp cuối cùng. Khi bệnh đã xảy ra, trước khi
xả bỏ, cần dùng thuốc diệt khuẩn (chlorine, formol) để sát trùng nước, diệt vi khuẩn (Đỗ
Thị Hòa và cs, 2004).
Có thể tăng hệ miễn dịch tự nhiên của động vật nuôi thủy sản bằng quản lý môi
trường tốt và bổ sung một số sản phẩm như vitamin C, A, E sẽ kích thích cơ quan tạo
kháng thể; hạn chế dùng hóa dược trong nuôi trồng thủy sản. Một biện pháp hữu hiệu
nhằm tăng sức đề kháng của tôm và các loài động vật thủy sản khác là sử dụng nhóm vi
sinh vật hữu ích gọi là vi sinh vật probiotic (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) như Zymetin, Dikaku
với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, vì vậy
dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả.
Với trình độ kĩ thuật như ngày nay, chưa có phương pháp điều trị nào có thể dập tắt
được các bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra cho động vật thủy sản nhưng có thể lựa chọn các
biện pháp khác nhau để khống chế và ngăn ngừa bệnh.
1.2. Tổng quan về Bacillus
1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn, tế bào hình que và thẳng, kích thước 0,5 –
2,5 x 1,2 – 10 μm, di động bằng chu mao, bắt màu Gram dương. Các loài thuộc chi
Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào
tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút. Mỗi tế bào sinh dưỡng thường
chỉ hình thành một nội bào tử. Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi
nảy nở mà để chịu đựng với các điều kiện bất lợi. Bào tử có màng nhiều lớp, chứa ít nước
tự do và do đó có thể chịu đựng tốt với nhiều tác động bất lợi có thể làm chết các tế bào
dinh dưỡng (Lương Đức phẩm, 1998; Gordon, 1973). Vi khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa
dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh
hơn. Các tế bào thường có hoạt tính catalase dương tính. Nhiều loài Bacillus có khả năng
kháng nhiệt, các pH cực trị, điều kiện khô hạn, tính mặn, chất khử và các phân tử có hại
khác (Gordon, 1973).
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
10
Chi Bacillus rất đa dạng về sinh lý và sinh thái. Một số chủng là hiếu khí bắt buộc
nhưng một số khác lại là kị khí tùy tiện. Các chủng của một số loài sinh trưởng tốt trong
môi trường chứa glucose, amonium sulphate và một vài muối khoáng nhưng các chủng
khác lại cần nhân tố sinh trưởng. Về điều kiện pH, đa số các chủng sinh trưởng tốt ở pH 7
nhưng B. alealophilus thì ở pH 9 – 10 và B. acidocaldarius thì ở pH 2 – 6. Về nhiệt độ, các
vi khuẩn ưa nóng sinh trưởng thích hợp ở 45 – 75
o
C hoặc cao hơn, còn các vi khuẩn ưa
11
trồng (Nguyễn Văn Hảo và cs, 2004; Arulampalam và cs, 1998; Walter và Stephenb,
1998). Mặt khác, nhiều loại vi sinh vật trở nên kháng thuốc và trở thành những mầm bệnh
nguy hiểm đối với vật nuôi. Một trong những hậu quả cực kỳ nghiêm trọng của hoạt động
trên là vấn đề dư lượng kháng sinh trong thủy sản đang được nhiều nước như EU, Mỹ,
Canada… sử dụng như một rào cản kỹ thuật để hạn chế sản phẩm thủy sản nhập từ Việt
Nam và nhiều nước khác. Các loại kháng sinh tạo ra các chủng kháng kháng sinh, các
plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh sẽ truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản
sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và người. Vì lẽ đó ngày nay nhiều loại kháng
sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi thủy sản. Bắt đầu từ năm 2006, cộng đồng châu Âu đã
cấm sử dụng tất cả các loại kháng sinh làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Phương pháp sử dụng các vi khuẩn có lợi, tức là các vi khuẩn probiotic, để loại trừ
các vi khuẩn có hại bằng quá trình cạnh tranh ngày càng được sử dụng nhiều hơn để thay
thế phương pháp sử dụng kháng sinh.
Kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản
Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất
sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm 1989,
Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có
khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật
trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ. Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa
hay dự phòng sinh học (Lương Đức Phẩm, 1998).
Cơ sở của việc ứng dụng các loại vi khuẩn probiotic này là khả năng sinh chất ức
chế vi khuẩn gây bệnh, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và năng lượng, cạnh tranh vị trí bám
dính với vi khuẩn có hại trên cơ thể động vật nuôi, cải thiện chất lượng nước, là nguồn
dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch của động vật nuôi
(Verschuere và cs, 2000).
Các chất ức chế do vi khuẩn probiotic sinh ra bao gồm: các chất kháng sinh,
bacteriocin, siderophores, lysozym, protease, hydroperoxit và các acid hữu cơ (làm biến
đổi giá trị pH). Sự có mặt của các chất ức chế này trong ruột của vật chủ, trên bề mặt hoặc
góp thêm enzyme cho vật chủ cũng như cung cấp các nguyên tố đa vi lượng cho vật chủ,
giúp chúng sử dụng thức ăn hiệu quả hơn và tăng trưởng tốt hơn (Phạm Văn Ty và Vũ
Nguyên Thành, 2007).
Riêng đối với nhóm vi khuẩn Bacillus, chúng có khả năng sinh các chất lipopeptide
và các chất kháng sinh (Stein, 2005; Verschuere và cs, 2000). Chất lipopeptide hoạt động
như chất hoạt hóa bề mặt do vậy tạo điều kiện để cho các tế bào vi khuẩn probiotic tiếp xúc
với tế bào vi khuẩn gây bệnh, do vậy các chất kháng sinh có thể xâm nhập vào tế bào
(Verschuere và cs, 2000). Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu
cơ chứa nitơ, như protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào (Lương Đức Phẩm,
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
13
1998), do đó nó có tác dụng lớn trong việc xử lý môi trường cải thiện chất lượng nước ao
nuôi.
Một số vi khuẩn probiotic chính hay được sử dụng trong nuôi tôm thuộc các chi:
Lactobacillus, Pseudomonas, Nitrobacter và Bacillus (Lai Thuy Hien và cs, 2005; Lê Thị
Bích Phượng và cs, 2003; Moriarty, 1999; Smith và Davey, 1993; Verschuere và cs, 2000).
Một nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn Bacillus đông lạnh cũng đem lại lợi ích. Các lợi ích
đã được chứng minh bao gồm khống chế bệnh dịch bằng vi khuẩn truyền bệnh V. harveyi,
thúc đẩy quá trình thực bào, tăng hoạt động của melanin và kháng khuẩn.
Các dòng Bacillus spp chọn lọc đã được sử dụng qua thực nghiệm để kiềm chế sự
lây nhiễm của các loài Vibrio (Moriarty, 1998; Rengpipat và cs, 1998). Cả Moriarty (1998)
và Rengpipat và cs (1998) đều chỉ ra rằng chế phẩm sinh học có thể có hiệu quả ngăn chặn
các loài vi khuẩn phát sáng Vibrio. Cơ chế can thiệp có thể là sự kết hợp của sự canh tranh
giữa các vi khuẩn và các hợp chất kháng sinh khác nhau do Bacillus spp tạo ra. Khi sử
dụng vi khuẩn Bacillus spp, mức phát sáng do vi khuẩn V. harveyi thấp hay gần như triệt
tiêu và cho kết quả nuôi rất tốt. Việc bổ sung thêm Bacillus spp. đã đem lại lợi ích cho tôm
trong việc chống bệnh phát sáng và khỏe mạnh hơn và dẫn tới việc tăng sản lượng nuôi.
Rất nhiều chế phẩm sinh học đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi tôm, đặc biệt tại
khu vực Châu Á. Các chế phẩm sinh học hoạt động như một phần trong tổng thể quản lý
1.3.2. Những nghiên cứu ở trong nước
Vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn có đặc tính probiotic được sử
dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học cho người và động vật. Từ các mẫu đất ao nuôi tôm,
phân giun làm thức ăn nuôi tôm, từ đường tiêu hóa của tôm, nhóm các nhà nghiên cứu Khuất
Hữu Thanh và cs (2009) đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn lactic và Bacillus. Trong đó
18/32 chủng vi khuẩn lactic và 12/28 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính đối kháng vi
khuẩn Vibrio và vi khuẩn kiểm định. Trong nghiên cứu này đã xác định trình tự 16S rRNA
của các chủng LPG 5, LRT8, BaD và BaRT. Chủng LPG 5 tương đồng 100% với chủng
Lactobacillus acidophilus LH5, chủng LRT8 tương đồng 98% với chủng Lactobacillus
helveticus IMAU40107, chủng BaD tương đồng 100% với chủng Bacillus subtilis EBS05,
chủng BaRT tương đồng 97% với chủng Bacillus sp. RSP-GLU. Chế phẩm probiotic tạo
được có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện thí nghiệm, tỷ lệ tôm sống
tăng khoảng 15%, trọng lượng tôm 120 ngày tuổi tăng khoảng 13% so với đối chứng.
Với mục tiêu chọn ra các chủng vi khuẩn probiotic có khả năng kháng vi khuẩn gây
bệnh cho tôm để tạo chế phẩm sinh học trong nước nhằm xử lý nước nuôi tôm công
nghiệp, Đặng Phương Nga và cs (2006) đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn
Bacillus sp. HY1 có khả năng kháng Vibrio tốt từ môi trường phân lập là nước nuôi tôm.
Tiếp sau nghiên cứu trên, Đặng Phương Nga và cs (2007) đã tiến hành nghiên cứu khả
năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio của Bacillus subtilis HY1.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
15
Ở Việt Nam những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi sinh để cải thiện
môi trường nuôi tôm hoặc có tác dụng probiotics còn tương đối ít. Trong những năm gần
đây Bộ thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh, nhiều nơi đã làm
quen với với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt, tuy nhiên cần có
một sự đánh giá toàn diện về hiệu quả kinh tế và phương pháp sử dụng.
Việc phân lập các chủng vi khuẩn probiotic là việc làm mang nhiều tính chất kinh
nghiệm, ít cơ sở khoa học, vì vậy có vô số các nghiên cứu về probiotic bị thất bại, điều đó
có thể là do việc lựa chọn các chủng vi sinh không thích hợp. Các bước lựa chọn được xác
NaCl
Cao nấm men
Agar
Nước cất
10g
10g
5g
15g
1 lít
Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,5, sau đó thêm agar vào. Hấp khử trùng ở 121
o
C
trong 15 phút.
+ Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS):
Cao nấm men
Peptone
Sucrose
Sodium thiosulfate.75H
2
O
Sodium citrate.72H
2
O
Sodium cholate
Oxgall
NaCl
Ferric citrate
Bromothymol blue
5g
10g
Cân 5g mẫu (ruột và cơ quan nội tạng của tôm sú) cho vào túi nilon, bổ sung 45 ml
canh thang tăng sinh để có độ pha loãng 10
-1
, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher
trong 1 phút (Trần Linh Thước, 2008). Sau đó cho vào bình tam giác và ủ qua đêm ở nhiệt
độ phòng. Mẫu sau khi đã ủ tăng sinh thì đem gia nhiệt ở 80 - 85
o
C trong 15 phút để tiêu
diệt các tế bào sinh dưỡng, chỉ còn lại bào tử Bacillus chịu nhiệt (Lương Đức Phẩm, 1998).
Các bình tam giác sau khi gia nhiệt được đậy kín và cho vào tủ ấm 30
o
C trong 2
ngày (Lương Đức Phẩm, 1998) để bào tử được hoạt hóa và mọc trở lại. Sau 24h đem pha
loãng thành các nồng độ 10
-2
đến 10
-7
. Hút 0,1 ml mẫu (Trần Linh Thước, 2008) từ ba
nồng độ 10
-5
, 10
-6
, 10
-7
cho vào môi trường thạch dinh dưỡng đã chuẩn bị trong các đĩa
petri vô trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ
đĩa thạch và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các đĩa petri đã cấy mẫu
vào tủ ấm 37
o
C trong 1 – 2 ngày. Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ
C trong 6 – 8 giờ (Trần Linh Thước, 2008). Mẫu sau
khi đã ủ tăng sinh thì đem pha loãng thành các nồng độ 10
-2
đến 10
-5
. Hút 0,1 ml mẫu từ ba
nồng độ 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
cho vào môi trường thạch TCBS đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô
trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch
và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các đĩa petri đã cấy mẫu vào tủ ấm
37
o
C trong 18 – 22 giờ (Trần Linh Thước, 2008). Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để
lựa chọn sơ bộ các loài thuộc chi Vibrio. Chúng được tách ra cấy ria nhiều lần để chọn các
dòng thuần chủng, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng (TCBS) trong ống
nghiệm để giữ giống.
2.2.4. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Vibrio
Tương tự như Bacillus, Vibrio cũng cần được nuôi cấy trước khi dùng cho các
nghiên cứu, thử nghiệm. Vibrio được chúng tôi nuôi trong môi trường APW, ở nhiệt độ 28
- 30
o
C, lắc 150 vòng/phút.
Các chủng Vibrio được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng (TCBS) trong ống
nghiệm, bảo quản ở 4 – 6
o
Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng
1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1
phút, sau đó rửa bằng nước cất.
Bước 4: Dùng cồn 95
o
tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu
(khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất.
Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau đó
rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính
dầu.
2.2.7. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi
Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn
Các chủng Bacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường LB, lắc với tốc độ 200
vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30
o
C. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu
bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm
trong cồn 95
o
. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
Copyright: Tài liệu đại học ©