BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC
BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội- 2019

BỘ GIÁO DỤC


VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

chỉ hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà còn trong cuộc
sống hàng ngày. Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng
cho tôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này.
Tôi cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tôn –Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phƣơng Nhung, Ths.Ma Thị Huyền
Thƣơng và Ths. Trần Thị Bích Ngọc đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Qua đây tôi cũng xin cảm ơn tất cả các
cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt
thời gian tôi thực tập tại đây. Để có đƣợc những hiểu biết về kiến thức chuyên
ngành, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở khoa Công nghệ sinh học Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích
trong suốt 2 năm học qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian
thực tập để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Thanh Hoa


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
UNBVM

U nguyên bào võng mạc

RB1

Retinoblastoma 1


Multiplex ligation-dependent probe amplification

UV

Ultra violet

TAE

Tris-axit axetic-EDTA

qPCR

Quantitative polymerase chain reaction

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DMSO

Dimethyl sulfoxide


Danh mục các bảng biểu và hình ảnh
BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng
mạc........................................................................................................................................................................ 8
Bảng 1.2 Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn . …….10

Bảng 1.3 Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia đình

Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM.......................................................... 53


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC.............4
1.1.1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam.........4
1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM........................................................6
1.1.3. Chẩn đoán UNBVM............................................................................6
1.1.4. Phân loại UNBVM..............................................................................8
1.1.5. Điều trị UNBVM...............................................................................10
1.1.6. Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc................13
1.1.7. Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc.........................................15
1.1.7.1.

t

p tron n u

1.1.7.2. Hoạt độn
1.1.7.3.

p

n

tt

np


2.1.3. Hóa chất.............................................................................................24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU.................................................................24
2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu....................................................................... 25
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA genomic............................................ 25
2.2.3. Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR).................................................26
2.2.4. Phƣơng pháp giải trình tự gen.......................................................... 30
2.2.5. Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA)..........................................................................................................31
2.2.6. Phƣơng pháp phân t ch kết quả.........................................................34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 36
3.1. KẾT QUẢ......................................................................................................36
3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu..................................................................36
3.1.2. Tách chiết DNA tổng số....................................................................39
3.1.3. PCR khuếch đại các đoạn gen RB1...................................................41
3.1.4. Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1...................................43
3.1.5. Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA.....................................46
3.2. THẢO LUẬN................................................................................................ 50
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................55
4.1. KẾT LUẬN.................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 56


MỞ ĐẦU
U

nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) là bệnh u ác tính

mắt thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1
(retinoblastoma 1). UNBVM xuất hiện với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ

bệnh. Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân UNBVM ở giai đoạn sớm đã
đƣợc thực hiện khá hiệu quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử
và nguyên nhân di truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tƣ vấn
di truyền hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho
gia đình bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có ngƣời mắc bệnh nhƣ
cha/mẹ hay anh/chị em ruột.
Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UNBVM, luận văn: “Sàng lọc đột
biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” đƣợc tiến
hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em
mắc u nguyên bào võng mạc. Nội dung nghiên cứu nhƣ sau:


Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung

ƣơng, và ngƣời thân trong gia đình nhƣ mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có).



Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi

DNA tại vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã của
gen
RB1.


Sử dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe

amplification) nhằm phát hiện các đột biến thêm/mất đoạn lớn trên gen RB1.
 Phân t ch kết quả nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UNBVM tại
Việt

nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em phát

sinh t các tế bào võng mạc nguyên thủy, bệnh thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi,
gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). Có khoảng 9000 trƣờng
hợp UNBVM mới đƣợc phát hiện mỗi năm, tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/15000 đến
1/20000 trẻ tƣơng ứng với, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ
thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-7]. Trên thế giới, ƣớc tính có khoảng 3001
đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Mỗi năm có 175.000 ca UNBVM
mắc mới đƣợc phát hiện ở các nƣớc đang phát triển, với tỷ lệ tử vong cao dƣới
15%. Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, cao thứ hai
thế giới (sau châu Phi 70%), Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y
tế [9]. Trong 100 năm qua, có sự tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và quản lý
UNBVM theo nguyên tắc ƣu tiên: Sống sót, Toàn cầu & Thị lực (Life, Globe &
Vision) [9, 17].
Ở

Việt Nam, chƣa có số liệu đầy đủ về tỷ lệ mắc UNBVM hàng năm. Tại

Bệnh viện Mắt trung ƣơng, số bệnh nhân mắc u nguyên bào võng mạc hàng năm
tăng t 29 ngƣời (2004) lên 68 ngƣời (2016), chủ yếu tập trung ở trẻ em lứa tuổi t
2-3 tuổi (theo hội thảo quốc tế chuyên đề về UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung
ƣơng năm 2017). Tuy số lƣợng không nhiều so với các bệnh lý khác nhƣng đây
là căn bệnh hiểm nghèo, nếu không đƣợc điều trị đúng, xử lý sớm sẽ ảnh hƣởng
tới thị lực thậm tr t nh mạng ngƣời bệnh. Phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai
đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị bảo tồn mắt. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra
trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền
4


với khả năng sinh bệnh. Hiện nay, ở Việt Nam, chẩn đoán phân tử bệnh UNBVM

Biểu hiện lâm sàng của UNBVM.

Biểu hiện UNBVM rất đa dạng bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt,
giảm thị lực và rung giật nhãn cầu, ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các
triệu chứng khác nhƣ: mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi
mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc,
trẻ chậm phát triển...[20]. Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất ở trẻ bị
UNBVM chiếm 60%, khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào
ban đêm hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2
đồng tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn flash. Dấu hiệu
nhận biết chính thứ hai là trẻ bị lác/lé, chiếm 20%. Đặc biệt, nếu bé bị lác trong
vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có UNBVM [21].
1.1.3.

Chẩn đoán UNBVM.

Chẩn đoán UNBVM có thể tiến hành theo các phƣơng pháp sau:
*

Chẩn đoán lâm sàng: Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng để chẩn

đoán bệnh. Tổn thƣơng ở võng mạc có biểu hiện khác nhau tùy theo hƣớng phát
triển của u. Các phƣơng pháp chẩn đoán hình ảnh giúp xác định chẩn đoán.
Khám siêu âm và chụp cắt lớp có thể thấy rõ k ch thƣớc và vị tr khối u hoặc thấy
hình ảnh canxi hóa trong khối u-dấu hiệu đặc trƣng của UNBVM. Ngoài ra còn
có thể xác định sự phát triển của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội sọ. Chụp
MRI cho ph p khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và não [22]. Quét
xƣơng toàn thân bằng Technetium-99m và chụp cắt lớp phát xạ positron
Fluorine-18 pos ourodeoxyglucose (PET CT) cũng rất hữu ch để phát hiện sớm
di căn [23]. Hầu hết trẻ em bị UNBVM không cần phải tiến hành chụp xƣơng.

di truyền phân tử là cần thiết để xác định xem UNBVM có phải là dạng di truyền
hay không và cho ph p chẩn đoán, sàng lọc sớm nguy cơ cho các thành viên
trong gia đình [20].
1.1.4.

Phân loại UNBVM

Chẩn đoán UNBVM đƣợc tiến hành trên cơ sở các phát hiện lâm sàng và
x t nghiệm hình ảnh. Xác định giai đoạn khối u tại thời điểm chẩn đoán là rất
quan trọng để quản lý th ch hợp, do đó kiến thức về hệ thống phân loại u nguyên
bào võng mạc là rất quan trọng. Phân loại Reese Ellsworth (Bảng 1.1) đƣợc phát
triển vào những năm 1960 bởi Tiến sĩ Algernon Reese và Tiến sĩ Robert
Ellsworth là hệ thống phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi nhất đối với các khối u
nội nhãn và dựa trên vị tr , số khối u và k ch thƣớc của khối u [25].
Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng
mạc [25]
Nhóm

Khả năng bảo tồn thị lực

I

Khả năng bảo tồn thị lực
rất cao

II

Khả năng bảo tồn thị lực
cao




Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]
Nhóm
A
Nguy cơ rất
thấp

B
Nguy cơ thấp
C
Nguy cơ trung
bình
D
Nguy cơ cao

E
Nguy cơ rất cao

1.1.5.

Điều trị UNBVM

Mục tiêu đầu tiên của điều trị là đảm bảo t nh mạng của ngƣời bệnh và
sau đó là thị lực. Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa
chọn phƣơng pháp điều trị dựa trên nhiều yếu tố bao gồm: số lƣợng các ổ khối u
(bị một bên và chỉ có một khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai bên
mắt), vị tr và k ch thƣớc khối u trong mắt, có gieo mầm vào pha lê thể và dƣới
võng mạc hay không, khả năng bảo tồn thị lực và tuổi bệnh nhân. Các phƣơng
pháp đƣợc sử dụng trong điều trị UNBVM bao gồm:

*

Tia xạ: Tia xạ với nguồn tia t ngoài vào (External beam radiotherapy viết

tắt EBRT) là phƣơng pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong UNBVM. Tia
xạ có thể chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào thủy tinh, các
khối u gần dây thần kinh thị trong mắt có khả năng còn thị lực hoặc nhiều khối u
mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phƣơng pháp lạnh hoặc quang
đông.
* Điều trị bằng các tấm có hoạt t nh phóng xạ: Liệu pháp tia phóng xạ để gần (I
– 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt t nh phóng xạ áp vào thành mắt ở góc của khối
u, có thể áp dụng nhƣ là phƣơng pháp điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu

11


thuật. Tuy nhiên, không phải là tất cả các bệnh nhân đều đƣợc điều trị bằng
phƣơng pháp này [22] [28].
*

Liệu pháp hóa học: UNBVM là một bệnh ác t nh nhạy cảm với hóa chất.

Hóa chất có hoạt t nh nhất nhƣ carboplatin, vincristin, có hoặc không có
etoposide.
Hó

t

ảm tế ào: Do hầu hết bệnh nhân có khối u lớn tại thời điểm


cách soi đáy mắt và ngăn ng a di căn [31]. Chawla và cộng sự phân t ch một
nhóm nhỏ trẻ em mắc UNBVM đã phát hiện ra rằng 39,2% trẻ em còn sống
không bị tái phát/di căn, 9% trẻ bị di căn và 51,8% trẻ tử vong. Di căn đến hệ
thần kinh trung ƣơng đƣợc ghi nhận ở 15,7% trẻ và mang tiên lƣợng xấu. Các
khối u ác t nh thứ phát đáng quan tâm trong đó có u xƣơng là phổ biến nhất [32].
1.1.6. Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc
Nguy cơ mắc UNBVM có thể đƣợc xác định t mối quan hệ của trẻ sơ sinh
với thành viên trong gia đình đã đƣợc chẩn đoán bị bệnh (Bảng 1.3) [33]. Trong
trƣờng hợp chƣa thực hiện hoặc không thể thực hiện đƣợc xét nghiệm di truyền,
nguy cơ mắc bệnh ƣớc tính có thể xác định đƣợc bằng cƣờng độ kiểm tra. Tuy
nhiên, nguy cơ mắc bệnh của một đứa trẻ có thể đƣợc xác định chính xác hơn
bằng phân tích di truyền của gia đình, thƣờng bắt đầu với việc thực hiện xét
nghiệm di truyền toàn bộ gen RB1 của một thành viên trong gia đình bị UNBVM
để xác định khả năng di truyền; nếu di truyền, đột biến gây bệnh sẽ đƣợc kiểm
tra một cách kĩ lƣỡng ở những ngƣời có nguy cơ cao.

13