BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ
----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn:
Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN
RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN
CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ
TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN
THẠC SĨ: SINH
HỌC THỰC


NGHI
ỆM

Hà Nội- 2019


NGƢỜI HƢỚNG
DẪN KHOA HỌC:

TS.Nguyễn Hải Hà
Hà Nội- 2019


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Sàng lọc đột biến gen RB1 thể
di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” là công trình nghiên cứu của
cá nhân tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc
công bố trong các công trình khác. Nếu không đúng nhƣ đã nêu trên, tôi xin
hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.
Hà Nội, tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Thanh Hoa


Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy - ngƣời chị không
chỉ hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà còn trong cuộc
sống hàng ngày. Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng
cho tôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này.
Tôi cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tôn –Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phƣơng Nhung, Ths.Ma Thị Huyền
Thƣơng và Ths. Trần Thị Bích Ngọc đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Qua đây tôi cũng xin cảm ơn tất cả các
cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt


Complement deoxyribonucleic acid

mRNA

Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin

bp

Base pair

dNTPS

Deoxyribonucleotide Triphosphate

PCR

Polymerase chain reaction

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

UV

Ultra violet

TAE

Tris-axit axetic-EDTA

HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của UNBVM......................................................................................... 7
Hình 1.2 Hình ảnh cắt lớp vi tính của UNBVM............................................................................ 7
Hình 1.3 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào.................................................... 12
Hình 1.4 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào.................................................... 12
Hình 1.5 Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1.........................16
Hình 1.6 Tái tổ hợp trong nguyên phân.......................................................................................... 17
Hình 1.7 Hoạt động bất thƣờng của DNA polymerase trong sao ch p DNA..............18
Hình 1.8 Sự phân chia bất thƣờng của nhiễm sắc thể trong nguyên phân...................19


Hình 1.9 Vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13...................................................................... 19
Hình 1.10 Cấu trúc gen và protein RB1.......................................................................................... 20
Hình 3.1 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu máu
bệnh nhân và gia đình............................................................................................................................... 39
Hình 3.2 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM.............................. 42
Hình 3.3 Sơ đồ biểu diễn các đột biến trên gen RB1 đƣợc phát hiện ở 23 bệnh
nhân.................................................................................................................................................................... 44
Hình 3.4 Kết quả dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau khi phân tích MLPA…49
Hình 4.1 Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh
nhân UNBVM............................................................................................................................................... 52
Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM.......................................................... 53


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC.............4
1.1.1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam.........4
1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM........................................................6

n

ms

tron t n

p

N .. 17

t......................................... 18

1.2. GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1...........................................................................19
1.3. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT
SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM...........................................................................................................21
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU....23
2.1. VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU........................................................................... 23
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................... 23
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị.......................................................................23


2.1.3. Hóa chất.............................................................................................24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU.................................................................24
2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu....................................................................... 25
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA genomic............................................ 25
2.2.3. Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR).................................................26
2.2.4. Phƣơng pháp giải trình tự gen.......................................................... 30
2.2.5. Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA)..........................................................................................................31

RB1 khác nhau phát hiện đƣợc ở bệnh nhân UNBVM và đã đƣợc công bố trên ngân
hàng dữ liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database) [11], và các đột biến
gen RB1 gây bệnh UNBVM không đồng nhất và xuất hiện rải rác trên vùng
promoter và 27 exon. Việc xác định đột biến gen RB1 gây bệnh trên bệnh nhân
UNBVM và gia đình là cơ sở để thực hiện điều trị cho bệnh nhân hiệu quả và tƣ
vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.
Việc chẩn đoán sớm và phƣơng pháp điều trị th ch hợp có vai trò quan trọng
trong việc tiên lƣợng và khả năng sống sót của bệnh nhân UNBVM [12]. Ở các
nƣớc phát triển, mục tiêu của điều trị là bảo tồn thị lực và việc kiểm tra gen RB1 đã
đƣợc áp dụng nhƣ là một kiểm tra định kì ở nhóm bệnh nhân UNBVM [13-16]. Ở
Việt Nam, phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị
bảo tồn mắt. Mặc dù rất nhiều kinh ph đã đƣợc đầu tƣ cho việc
1


phát triển các kỹ thuật điều trị lâm sàng nhƣng phát triển các kĩ thuật sinh học
phân tử phục vụ chẩn đoán sớm của bệnh UNBVM gần đây mới thực sự phát
triển. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã
cho thấy vai trò của yếu tố di truyền với khả năng sinh bệnh, do đó việc phát
hiện sớm đột biến trên gen RB1 đóng vai trò quan trọng trong quản lý lâm sàng
cũng nhƣ dự đoán nguy cơ mắc bệnh của các thành viên trong gia đình ngƣời
bệnh. Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân UNBVM ở giai đoạn sớm đã
đƣợc thực hiện khá hiệu quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử
và nguyên nhân di truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tƣ vấn
di truyền hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho
gia đình bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có ngƣời mắc bệnh nhƣ
cha/mẹ hay anh/chị em ruột.
Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UNBVM, luận văn: “Sàng lọc đột
biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” đƣợc tiến
hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em


UNBVM.

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC
1.1.1.
U

Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam

nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em phát

sinh t các tế bào võng mạc nguyên thủy, bệnh thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi,
gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). Có khoảng 9000 trƣờng
hợp UNBVM mới đƣợc phát hiện mỗi năm, tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/15000 đến
1/20000 trẻ tƣơng ứng với, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ
thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-7]. Trên thế giới, ƣớc tính có khoảng 3001
đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Mỗi năm có 175.000 ca UNBVM
mắc mới đƣợc phát hiện ở các nƣớc đang phát triển, với tỷ lệ tử vong cao dƣới
15%. Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, cao thứ hai
thế giới (sau châu Phi 70%), Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y
tế [9]. Trong 100 năm qua, có sự tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và quản lý
UNBVM theo nguyên tắc ƣu tiên: Sống sót, Toàn cầu & Thị lực (Life, Globe &
Vision) [9, 17].
Ở

đáng tin cậy để áp dụng nhằm tăng độ nhạy trong chẩn đoán di truyền của bệnh
UNBVM. Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã công bố một số kết quả bƣớc đầu của
nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 của 34 bệnh nhân UNBVM trên tạp
ch Molecular Vision (Mỹ), [18]. Cũng trên tạp ch này gần đây nhất, nhóm nghiên
cứu ph a Nam của giáo sƣ Nguyễn Công Kiệt đã công bố kết quả kiểm tra di
truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân UNBVM điều trị tại Bệnh viện
mắt thành phố Hồ Ch Minh. Với nghiên cứu này, các tác giả đã xác định dƣợc
phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh dƣỡng và đột biến dòng mầm
trên nhóm bệnh nhân này [19]

5


1.1.2.

Biểu hiện lâm sàng của UNBVM.

Biểu hiện UNBVM rất đa dạng bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt,
giảm thị lực và rung giật nhãn cầu, ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các
triệu chứng khác nhƣ: mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi
mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc,
trẻ chậm phát triển...[20]. Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất ở trẻ bị
UNBVM chiếm 60%, khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào
ban đêm hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2
đồng tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn flash. Dấu hiệu
nhận biết chính thứ hai là trẻ bị lác/lé, chiếm 20%. Đặc biệt, nếu bé bị lác trong
vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có UNBVM [21].
1.1.3.

Chẩn đoán UNBVM.

mất đoạn hay sự sắp xếp lại liên quan đến 13q14.1-14q2, tìm thấy trên khoảng
5% các trƣờng hợp bị UNBVM một bên mắt và khoảng 7.5% các trƣờng hợp bị
cả hai bên mắt [20].
*

Kiểm tra di truyền phân tử:

Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UNBVM là rất quan trọng để
bảo tồn cuộc sống và thị lực. X t nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan
trọng trong việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UNBVM. Gen RB1 là gen ức
chế khối u đầu tiên đƣợc xác định, phần lớn các đột biến RB1 là riêng cho t ng
gia đình, và đƣợc phân bố trên khắp gen RB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã
hóa exon, và khu vực nối của intron [24]. Việc chẩn đoán UNBVM thể di truyền
đƣợc tiến hành ở các bệnh nhân mang bệnh hoặc có tiền sử gia đình, trong đó
phần lớn các bệnh nhân bị bệnh không có tiền sử gia đình. Do đó việc xác định
7


một biến thể gây bệnh dòng mầm dạng dị hợp tử trên gen RB1 trong x t nghiệm
di truyền phân tử là cần thiết để xác định xem UNBVM có phải là dạng di truyền
hay không và cho ph p chẩn đoán, sàng lọc sớm nguy cơ cho các thành viên
trong gia đình [20].
1.1.4.

Phân loại UNBVM

Chẩn đoán UNBVM đƣợc tiến hành trên cơ sở các phát hiện lâm sàng và
x

t nghiệm hình ảnh. Xác định giai đoạn khối u tại thời điểm chẩn đoán là rất

tồn thị lực

Rất khó khăn trong bảo
V

tồn thị lực

Hệ thống phân loại Reese Ellsworth về cơ bản đƣợc thiết kế để dự đoán
kết quả điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài (EBRT), đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ
là phƣơng pháp điều trị bảo tồn mắt ch nh cho đến khi điều trị bằng hóa trị liệu
đƣợc sử dụng vào những năm 1990. Một số nhƣợc điểm của hệ thống phân loại
này nhƣ sau: các khối u ngoại biên, nhiều khối u và khối u lớn đƣợc cho là nguy
hiểm hơn trong giai đoạn điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài và có tiên lƣợng xấu
hơn ở mắt. Hệ thống phân loại Reese Ellsworth không giải quyết đƣợc vấn đề
gieo hạt dƣới võng mạc và không phân biệt giữa gieo hạt vào thủy tinh khu trú
và khuếch tán [26]. Do đó, cần phải đề xuất một hệ thống phân loại mới có thể
dự đoán kết quả điều trị bằng hóa trị liệu ch nh xác hơn. Nhiều trung tâm đã
tham gia và thống nhất một hệ thống phân loại duy nhất đƣợc thiết kế bởi
Murphree và các cộng sự (Bảng 1.2) [27]


9


Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]
Nhóm
A
Nguy cơ rất
thấp




kinh thị. Ngƣời ta hay kho t bỏ nhãn cầu hơn cho những mắt đã thất bại với các
phƣơng pháp điều trị bảo tồn trƣớc đó. Ngoài ra, kho t bỏ nhãn cầu đƣợc chỉ
định cho trƣờng hợp tăng nhãn áp thứ phát, gieo mầm vào thủy tinh, hoặc xâm
lấn ra tiền phòng.
*
k

Lạn đôn : Chỉ định cho khối u nhỏ cho những u nhỏ (< 6 mm đƣờng

nh và < 3 mm độ dày) và ở ph a trƣớc. Trong quá trình lạnh đông, một chất rất

lạnh nhƣ nitơ lỏng, đƣợc đặt trong hoặc gần các tế bào ung thƣ.Một khi các tế
bào đóng băng, chất lạnh đƣợc loại bỏ và các tế bào tan băng. Quá trình đóng
băng và tan băng này, lặp đi lặp lại một vài lần trong mỗi đợt trị liệu, khiến các tế
bào ung thƣ bị chết. Biến chứng của phƣơng pháp này gồm bong võng mạc tơ
huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc và xơ hóa
tiền võng mạc.
*

Liệu pháp laser: Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định

cho u nhỏ và ở ph a sau. Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của
laser Argon để phá hủy mạch máu nuôi dƣỡng tế bào khối u.
*

Tia xạ: Tia xạ với nguồn tia t ngoài vào (External beam radiotherapy viết

tắt EBRT) là phƣơng pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong UNBVM. Tia


Hình 1.3: Soi đáy mắt trƣớc điều trị

Hình 1.4: Soi đáy mắt sau điều trị hóa

hóa chất giảm tế bào

chất giảm tế bào

Nguồn: />
Trƣớc đây, việc loại bỏ nhãn cầu đã đƣợc sử dụng để điều trị cho những
bệnh nhân mắc UNBVM nặng. Hiện nay có bằng chứng cho thấy cách tiếp cận
phối hợp nhiều phƣơng pháp bao gồm hóa trị thu nhỏ khối u, phẫu thuật loại bỏ
nhân, EBRT và hóa trị ngăn ng a có hiệu quả trong các trƣờng hợp khối u lan ra
12