BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC
BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội- 2019


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ


Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy - ngƣời chị không
chỉ hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà còn trong cuộc
sống hàng ngày. Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng
cho tôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này.
Tôi cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tôn –Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phƣơng Nhung, Ths.Ma Thị Huyền
Thƣơng và Ths. Trần Thị Bích Ngọc đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Qua đây tôi cũng xin cảm ơn tất cả các
cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt
thời gian tôi thực tập tại đây. Để có đƣợc những hiểu biết về kiến thức chuyên
ngành, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở khoa Công nghệ sinh học Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích
trong suốt 2 năm học qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian
thực tập để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Thanh Hoa


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
UNBVM

U nguyên bào võng mạc


Polymerase chain reaction

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

UV

Ultra violet

TAE

Tris-axit axetic-EDTA

qPCR

Quantitative polymerase chain reaction

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DMSO

Dimethyl sulfoxide


Danh mục các bảng biểu và hình ảnh
BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng

Hình 3.4 Kết quả dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau khi phân tích MLPA…49
Hình 4.1 Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh
nhân UNBVM .......................................................................................................... 52
Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM. .......................................... 53


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC ............ 4
1.1.1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam......... 4
1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM. ...................................................... 6
1.1.3. Chẩn đoán UNBVM. ........................................................................... 6
1.1.4. Phân loại UNBVM .............................................................................. 8
1.1.5. Điều trị UNBVM............................................................................... 10
1.1.6. Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc ................ 13
1.1.7. Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc......................................... 15
1.1.7.1.

t

p tron n u n p n ........................................................... 17

1.1.7.2. Hoạt độn
1.1.7.3.

p n

tt


2.2.3. Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR) ................................................. 26
2.2.4. Phƣơng pháp giải trình tự gen ........................................................... 30
2.2.5. Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA) .......................................................................................................... 31
2.2.6. Phƣơng pháp phân t ch kết quả ......................................................... 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 36
3.1. KẾT QUẢ ...................................................................................................... 36
3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu .................................................................. 36
3.1.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................... 39
3.1.3. PCR khuếch đại các đoạn gen RB1 ................................................... 41
3.1.4. Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1 ................................. 43
3.1.5. Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA .................................... 46
3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................ 50
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 55
4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 56


MỞ ĐẦU
U nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) là bệnh u ác tính
mắt thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1
(retinoblastoma 1). UNBVM xuất hiện với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ
tƣơng ứng với khoảng 9000 trƣờng hợp mới mỗi năm, bệnh xảy ra ở cả hai giới
tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-8]. Trên thế giới,
ƣớc tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Tỷ lệ tử
vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, Canada và Mỹ (3–5%) do
khoảng cách về tiếp cận y tế [9]. Hầu hết các trƣờng hợp UNBVM đều liên quan
đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp chế khối u RB1 nằm trên nhiễm
sắc thể số 13 [7]. Khoảng 40% trẻ UNBVM là thể di truyền trong khi 60%
trƣờng hợp còn lại là thể không di truyền [10]. RB1 là gen áp chế khối u đầu tiên

hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em
mắc u nguyên bào võng mạc. Nội dung nghiên cứu nhƣ sau:
 Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung
ƣơng, và ngƣời thân trong gia đình nhƣ mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có).
 Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi DNA tại
vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã của gen
RB1.
 Sử dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
nhằm phát hiện các đột biến thêm/mất đoạn lớn trên gen RB1.
 Phân t ch kết quả nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UNBVM tại Việt
Nam.

2




nghĩa của đề tài: Nghiên cứu này bƣớc đầu tao ra cơ sở dữ liệu đột biến
gen của bênh nhân UNBVM ở Việt Nam. Kết quả thu đƣợc có thể làm sáng
tỏ nguyên nhân gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn
đoán, chữa trị và tƣ vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình ngƣời bệnh
UNBVM.

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC

UNBVM đã bắt đầu phát triển và đã đạt đƣợc một số thành tựu. Năm 2005,
Nguyễn Công Kiệt và Nguyễn Tr Dũng đã sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào
nghiên cứu 30 ca võng mạc ở Việt Nam và xác định đƣợc một bệnh nhân bị đột
biến mất đoạn ở vị tr nhiễm sắc thể 13q14 [1]. T năm 2013 nhóm nghiên cứu
của chúng tôi, đứng đầu là tiến sỹ Nguyễn Hải Hà, đã bắt đầu xây dựng quy trình
sàng lọc biến đổi di truyền cho bệnh nhân UNBVM Việt Nam sử dụng kỹ thuật
giải trình tự trực tiếp. Năm 2014, nhóm đã công bố hai đột biến gen thể di phát
hiện đƣợc t mẫu máu của bệnh nhân UNBVM [2]. Năm 2016, nhóm đã xây dựng

thành công phƣơng pháp sàng lọc đột biến gen RB1 thông qua phân t ch bản
phiên mã của gen này [3]. Kết hợp hai phƣơng pháp x t nghiệm trên DNA và
cDNA trong sàng lọc đột biến gen RB1 ở một gia đình có hai con mắc bệnh ung
thƣ võng mạc đã phát hiện đƣợc ngƣời cha và hai con đều mang đột biến gây ảnh
hƣởng tới sự tổ hợp lại mRNA của RB1. Năm 2017, chúng tôi đã sử dụng
phƣơng pháp MLPA nhằm phát hiện những đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn trên
gen RB1 ở những bệnh nhân UNBVM [4]. Kết quả nghiên cứu cho thấy phƣơng
pháp này hoàn toàn đáng tin cậy để áp dụng nhằm tăng độ nhạy trong chẩn đoán
di truyền của bệnh UNBVM. Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã công bố một số
kết quả bƣớc đầu của nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 của 34 bệnh
nhân UNBVM trên tạp ch Molecular Vision (Mỹ), [18]. Cũng trên tạp ch này
gần đây nhất, nhóm nghiên cứu ph a Nam của giáo sƣ Nguyễn Công Kiệt đã
công bố kết quả kiểm tra di truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân
UNBVM điều trị tại Bệnh viện mắt thành phố Hồ Ch Minh. Với nghiên cứu
này, các tác giả đã xác định dƣợc phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh
dƣỡng và đột biến dòng mầm trên nhóm bệnh nhân này [19]

5


1.1.2.

6


Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của

Hình 1.2Hình ảnh chụp cắt lớp vi

UNBVM

t nh của UNBVM

N uồn:

https://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-bao-

vong-mac-1236.html
* Kiểm tra mô bệnh học và phân t ch nhiễm sắc thể. Chẩn đoán UNBVM
có thể đƣợc xác định bằng kiểm tra mô bệnh học. Kiểm tra cẩn thận các dây thần
kinh thị giác là cần thiết để xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối u.
Phân t ch di truyền học tế bào lympho máu ngoại vi đƣợc sử dụng để phát hiện
mất đoạn hay sự sắp xếp lại liên quan đến 13q14.1-14q2, tìm thấy trên khoảng
5% các trƣờng hợp bị UNBVM một bên mắt và khoảng 7.5% các trƣờng hợp bị
cả hai bên mắt [20].
* Kiểm tra di truyền phân tử:
Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UNBVM là rất quan trọng để
bảo tồn cuộc sống và thị lực. X t nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan
trọng trong việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UNBVM. Gen RB1 là gen ức
chế khối u đầu tiên đƣợc xác định, phần lớn các đột biến RB1 là riêng cho t ng
gia đình, và đƣợc phân bố trên khắp gen RB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã
hóa exon, và khu vực nối của intron [24]. Việc chẩn đoán UNBVM thể di truyền


a, Khối u đặc, k ch thƣớc 4 DD, tất cả đều tại
hoặc sau đƣờng x ch đạo.

II

Khả năng bảo tồn thị lực
cao

a, Khối u đặc, k ch thƣớc 4-10 DD, tại hoặc sau
đƣờng x ch đạo.
b, Nhiều khối u, k ch thƣớc 4-10 DD, sau đƣờng
x ch đạo.

III

Có thể bảo tồn thị lực

a, Bất kỳ tổn thƣơng nào ở trƣớc đƣờng x ch đạo.
b, Khối u đặc > 10 DD, ở sau đƣờng x ch đạo

I

8


IV


Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]
Đặc điểm lâm sàng

Nhóm
A
Nguy cơ rất
thấp

Tất cả các khối u có k ch thƣớc 3 mm hoặc nhỏ hơn, giới hạn ở
võng mạc và nằm cách dây thần kinh thị giác t nhất 1.5 mm. Không
gieo hạt vào thủy tinh thể

B
Nguy cơ thấp

Các khối u võng mạc có bất kỳ k ch thƣớc hoặc vị tr nào không
thuộc nhóm A. Không gieo hạt vào thủy tinh thể. Một lƣợng nhỏ
dịch k o dài không quá 5 mm t nh t khối u đƣợc cho ph p.

C
Nguy cơ trung
bình

Gieo rắc hạt tại chỗ. Hạt thủy tinh có thể k o dài không quá 3 mm t
khối u. Có thể có tới một phần tƣ dịch dƣới màng lƣới.

D
Nguy cơ cao

Gieo rắc hạt lan tràn, khối u có thể to hơn một phần tƣ của võng

k nh và < 3 mm độ dày) và ở ph a trƣớc. Trong quá trình lạnh đông, một chất rất
lạnh nhƣ nitơ lỏng, đƣợc đặt trong hoặc gần các tế bào ung thƣ.Một khi các tế
bào đóng băng, chất lạnh đƣợc loại bỏ và các tế bào tan băng. Quá trình đóng
băng và tan băng này, lặp đi lặp lại một vài lần trong mỗi đợt trị liệu, khiến các
tế bào ung thƣ bị chết. Biến chứng của phƣơng pháp này gồm bong võng mạc tơ
huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc và xơ hóa
tiền võng mạc.
* Liệu pháp laser: Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định
cho u nhỏ và ở ph a sau. Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của
laser Argon để phá hủy mạch máu nuôi dƣỡng tế bào khối u.
* Tia xạ: Tia xạ với nguồn tia t ngoài vào (External beam radiotherapy viết
tắt EBRT) là phƣơng pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong UNBVM. Tia
xạ có thể chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào thủy tinh, các
khối u gần dây thần kinh thị trong mắt có khả năng còn thị lực hoặc nhiều khối u
mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phƣơng pháp lạnh hoặc quang
đông.
* Điều trị bằng các tấm có hoạt t nh phóng xạ: Liệu pháp tia phóng xạ để gần
(I – 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt t nh phóng xạ áp vào thành mắt ở góc của
khối u, có thể áp dụng nhƣ là phƣơng pháp điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu

11


thuật. Tuy nhiên, không phải là tất cả các bệnh nhân đều đƣợc điều trị bằng phƣơng
pháp này [22] [28].
* Liệu pháp hóa học: UNBVM là một bệnh ác t nh nhạy cảm với hóa chất.
Hóa chất có hoạt t nh nhất nhƣ carboplatin, vincristin, có hoặc không có
etoposide.
Hó


soát khối u hiệu quả hơn và an toàn hơn đã đƣợc quan sát với phƣơng pháp VEC
khi so sánh một phác đồ 5 thuốc bao gồm carboplatin và etoposide, xen kẽ với
cyclophosphamide, idarubicin và vincristine. Hóa trị liệu liều cao đƣợc tiếp tục
trong 12 chu kỳ và theo dõi chặt chẽ với mục đ ch loại bỏ hoàn toàn khối u bằng
cách soi đáy mắt và ngăn ng a di căn [31]. Chawla và cộng sự phân t ch một
nhóm nhỏ trẻ em mắc UNBVM đã phát hiện ra rằng 39,2% trẻ em còn sống
không bị tái phát/di căn, 9% trẻ bị di căn và 51,8% trẻ tử vong. Di căn đến hệ
thần kinh trung ƣơng đƣợc ghi nhận ở 15,7% trẻ và mang tiên lƣợng xấu. Các
khối u ác t nh thứ phát đáng quan tâm trong đó có u xƣơng là phổ biến nhất [32].
1.1.6.

Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Nguy cơ mắc UNBVM có thể đƣợc xác định t mối quan hệ của trẻ sơ
sinh với thành viên trong gia đình đã đƣợc chẩn đoán bị bệnh (Bảng 1.3) [33].
Trong trƣờng hợp chƣa thực hiện hoặc không thể thực hiện đƣợc xét nghiệm di
truyền, nguy cơ mắc bệnh ƣớc tính có thể xác định đƣợc bằng cƣờng độ kiểm tra.
Tuy nhiên, nguy cơ mắc bệnh của một đứa trẻ có thể đƣợc xác định chính xác
hơn bằng phân tích di truyền của gia đình, thƣờng bắt đầu với việc thực hiện xét
nghiệm di truyền toàn bộ gen RB1 của một thành viên trong gia đình bị UNBVM
để xác định khả năng di truyền; nếu di truyền, đột biến gây bệnh sẽ đƣợc kiểm
tra một cách kĩ lƣỡng ở những ngƣời có nguy cơ cao.

13


Bảng 1.3: Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia
đình trẻ mắc UNBVM [33]
Nguy cơ mang đột biến gây bệnh (%)
Mối quan hệ với bệnh

Chú/dì

0.1

0.007

Anh chị em họ gần nhất

0.05

0.007

Ngƣời bình thƣờng

0.007

Xét nghiệm phân tử xác định đột biến RB1 giúp làm rõ nguy cơ mắc
UNBVM của các thành viên trong gia đình, do đó có thể giảm cƣờng độ kiểm tra
mắt chuyên khoa ở một số trẻ em, cho phép trẻ trải qua tầm soát t hơn. X t
nghiệm và tƣ vấn di truyền cho UNBVM là một vấn đề phức tạp và cần sự phối
hợp chặt chẽ giữa bác sĩ với các chuyên gia di truyền (cố vấn di truyền hoặc các
nhà di truyền y học) có kinh nghiệm. Ví dụ, mặc dù bố mẹ của một đứa trẻ bị
UNBVM cả hai bên mắt có thể xét nghiệm âm tính với đột biến RB1, nhƣng vẫn
có 5% nguy cơ sinh ra những đứa trẻ tiếp theo bị bệnh vì khả năng có thể bố mẹ
bị đột biến RB1 dạng khảm dòng mầm. Việc sàng lọc trƣớc sinh là rất quan trọng
đối với những gia đình có tiền sử mắc UNBVM. Nếu có tiền sử gia đình mắc
UNBVM mang đột biến gen RB1 thì trẻ sinh ra cũng có nguy cơ cao mang khối
u võng mạc. Khi cha mẹ có mong muốn kiểm tra trong thai kỳ để phát hiện đột
14




bệnh, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một gen RB1 đột biến, chỉ
cần trải qua một sự kiện đột biến trên tế bào soma là có khả năng gây nên kiểu
hình ung thƣ. Bất kể các đột biến ban đầu là do di truyền hay do phát sinh trên tế
bào soma, các tế bào võng mạc chỉ trở thành ác tính khi bị mất bản sao bình
thƣờng còn lại của RB1. Mất alen RB1 chức năng thứ hai có thể là do một đột
biến soma riêng biệt (~30% các khối u), sự methyl hóa quá mức (tỷ lệ nhỏ các
khối u), hoặc mất trạng thái dị hợp tử (~70% các khối u). Mất trạng thái dị hợp
xảy ra do tái tổ hợp trong nguyên phân bào, phân ly bất thƣờng của nhiễm sắc
thể, hoặc mất đoạn lớn [39].

Hình 1.5: Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1[40]
T đó, ngƣời ta đƣa ra một số giả thuyết gây nên hiện tƣợng đột biến
trên gen Rb1 gồm: Tái tổ hợp trong nguyên phân, hoạt động bất thƣờng của
DNA polymerase trong tổng hợp DNA và sự phân chia bất thƣờng của nhiễm
sắc thể [40].

16