ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐOÀN HOÀNG THU
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO
GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN TẾ
BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG ĐIỀU
TRỊ VẾT THƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐOÀN HOÀNG THU
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA TẾ
BÀO GỐC MỠ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐẾN
TẾ BÀO DA NUÔI CẤY ĐỊNH HƯỚNG TRONG
ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Khả năng tạo dòng của tế bào mới tách ra từ mô mỡ (n=5).............
Error:
Reference source not found
Bảng 2. Khả năng tạo CFUF theo các thế hệ tế bào (n=5)..........
Error: Reference
source not found
Bảng 3. Ảnh hưởng của tế bào gốc đến tăng sinh nguyên bào sợi Error: Reference
source not found
Bảng 4. Thời điểm nguyên bào sợi gia tăng số lượng khi có tấm tế bào gốc.......
Error:
Reference source not found
Bảng 5. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi sau khi trypsin. Error: Reference source not
found
Bảng 6. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc đến tăng sinh tế bào sừng...............
Error:
Reference source not found
Hình 6. Tế bào sau 4 và 10 ngày nuôi cấy............
Error: Reference source not found
Hình 7. Tế bào gốc mỡ trên kính hiển vi đảo ngược 50X(A) và 100X(B)........
Error:
Reference source not found
Hình 8. Hình thái tế bào gốc mỡ sau khi nhuộm Giemsa. (100X) ..
. Error: Reference
source not found
Hình 9. Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ 1 và 5. (50X) Error: Reference source
not found
Hình 10. Tế bào gốc mỡ tạo colony ở ngày thứ 10 và 20. (50X)....
Error: Reference
source not found
Hình 11. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa....
Error: Reference source not found
Hình 12. Biểu đồ so sánh số lượng tế bào thu được giữa các thí nghiệm đồng
nuôi cấy tấm tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi ở ngày thứ 2. Error: Reference
source not found
Hình 13. Tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ lên sự tăng sinh của nguyên bào
Error: Reference source not found
Hình 18. Ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ lên di cư và biệt hóa của tế bào sừng
(50X).
.....................................................................
Error: Reference source not found
Hình 19. So sánh hình thái tế bào gốc mô
mỡ…………………………….Error: Reference source not found
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AB
Antibiotic/Antimycotic Kháng sinh
ADSCs
AdiposeDerived Stem Cells Tế bào gốc mỡ
DMEM
Dubeco’s Modified Eagle Medium
EGF
Epidermal Growth Factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì
Passage Cấy chuyển
PBS
Phosphat Buffer Saline Dung dịch đệm phosphat
PDGF
PleteletDerived Growth Factor
TB
Tế bào
TGF
Transforming Growth Factor
VEGF
Vessle Endothelial Growth Factor
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lôi cuốn nhất hiện
nay. Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã được y học thế giới lựa chọn như là liệu
pháp hữu hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan
đến máu, tủy, xương khớp…Trên thế giới, có một số nguồn tế bào gốc được
dụng bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế bào trong hỗn dịch tế bào
mới tách là đủ để cho một lần ghép điều trị vết thương. Do đó, cần nghiên
cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mô. Nếu
như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di
cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho
việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và
định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều
trị các tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết
bỏng.
Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn,
cụ thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang
các vết thương mạn tính. Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000
người cần được điều trị bằng da nhân tạo. Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu
người bị loét và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị.
Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn về
bỏng [8]. Tuy chưa có con số thống kê cụ thể nhưng chỉ tính riêng tại Viện
Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị thì nhu
cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào
gốc mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng tăng sinh
của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định
hướng trong điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau:
1. Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong
điều kiện nuôi cấy invitro
2. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy
Chương 1
Metalloproteinase, collagenase gây thoái huỷ protein khoảng kẽ; men
Stomalysin thoái huỷ protein màng nền. Điều hoà tổng hợp và thoá biến
collagen thông qua FGF , TGF . Sắp xếp collagen theo cấu trúc mô. Trong
khoảng thời gian từ 57 ngày, các nguyên bào sợi tăng sinh, và được kích thích
tiết PDGF, TGFbeta để điều khiển quá trình tổng hợp và lắng đọng các thành
phần đệm gian bào bao gồm: fibronectin, laminin, glycosaminoglycans (GAGs)
và collagen. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra
trong nhiều năm sau khi vết thương đã liền.
Tế bào sừng (Keratinocytes) tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể. Biểu
bì gồm nhiều lớp tế bào biểu mô lát tầng sừng hóa, thành phần chính là các tế
bào sừng gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau [1]. Lớp mầm hay
còn gọi là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái
sinh nhiều lần và nhanh trong suốt cuộc sống của con người. Giữa các tế bào
sừng có các cầu nối gian bào làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau. Các
tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ
dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển
lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên. Trong các tế bào của lớp
mầm biểu bì thì chỉ có 10% là tế bào mầm biểu bì còn lại là các tế bào đang ở
các giai đoạn gián phân. Bình thường sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân
bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhưng khi da bị tổn thương thì
chúng tăng cường phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu
mô sẽ di cư vào trung tâm của vết thương ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế
bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành
các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của
biểu bì. Trong quá trình di cư chúng cần đệm gian bào đủ chất lượng như
trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trượt dọc theo
các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thương. Trong trường hợp các vết
thương mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thương không hồi phục, vết
Các vật liệu thay thế da này được chế tạo dựa trên các tiến bộ về công
nghệ mô và đã được ứng dụng trong lâm sàng, chúng thúc đẩy sự liền vết
thương cấp và mạn tính và được sử dụng như một cơ quan phức hợp cho hệ
thống thử nghiệm cơ bản hoặc các nghiên cứu về dược [59]. Một vấn đề chính
trong việc tăng sinh tế bào là đáp ứng yêu cầu cần đạt đủ số lượng các tế bào
cần thiết, trong khi vẫn đảm bảo được tính chất bình thường của tế bào và cả
chức năng của chúng. Các tế bào này sau đó chỉ được sử dụng cho các mục đích
hoặc là tạo vật liệu thay thế da phù hợp cho cấy ghép hoặc là cho các thử
nghiệm in vitro [27], [66].
Có rất nhiều lý do gây nên tổn thương da bao gồm các hội chứng do gen,
chấn thương cấp tính, vết thương mạn tính hoặc các can thiệp ngoại khoa.
Một trong các lý do phổ biến nhất là tổn thương da do bỏng. Ngay khi da bị
tổn thương, hàng loạt các vấn đề phức hợp bắt đầu diễn ra: các tế bào miễn
dịch bị lôi kéo tới vùng thương tổn, mô đệm mới được sinh ra bởi nguyên bào
sợi, tiếp theo là tái biểu mô hóa do tế bào sừng đảm nhiệm và cuối cùng là sự
tái phân bố mạch của vết thương [54]. Quá trình liền vết thương phức tạp này
được kích thích và kiểm soát bởi các cytokine và các yếu tố tăng trưởng khác
nhau [25]. Kích thước vết thương là yếu tố chủ đạo cho biểu mô hóa. Tổn
thương toàn bộ lớp da với kích thước lớn hơn 1 cm đường kính thì cần phải
ghép da để đề phòng tạo sẹo dẫn đến di chứng về chức năng hay thẩm mỹ
[55]. Mảnh ghép hoàn hảo nên phải sẵn có, không gây đáp ứng miễn dịch, che
phủ và bảo vệ nền vết thương, làm tăng nhanh liền vết thương, ít gây đau và
ít tạo sẹo.
Trong trường hợp tổn thương diện tích rộng các tế bào có chức năng
liền vết thương của bệnh nhân không đủ khả năng làm lành tổn thương mà
cần phải ghép da tự thân nhưng nguồn da tự thân cũng không phải vô hạn nên
ghép da tự thân cũng chỉ cứu được những bệnh nhân bỏng sâu 50% diện tích cơ
mô đang được mô tả như vật liệu thay thế da giúp liền vết thương và sửa
chữa, thay thế da tạm thời và thường hỗ trợ cho việc tái sinh. Quá trình liền
vết thương, vết bỏng có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là
tái lập các mô tế bào đã bị tổn thương. Do đó, quan niệm mới trong điều trị
các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trên cơ thể là các tế bào tổn thương phải
được thay thế bằng các tế bào khỏe mạnh [4].
Cho đến ngày nay, người ta đã chế tạo được các tấm nguyên bào sợi,
tấm tế bào sừng, thậm chí cả các tấm vật liệu chứa cả hai loại tế bào trên mà
người ta gọi là các vật liệu tương đương da hoặc da nhân tạo…[57], [70].
Tuỳ theo nguồn gốc tế bào sừng trên tấm vật liệu là tự thân hay khác gen
đồng loài (gọi tắt là đồng loài) mà người ta chế được vật liệu có tính chất
vĩnh viễn (không thải ghép) hoặc tạm thời.
Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tương đương da được ứng
dụng trong điều trị bỏng, vết thương mạn tính trong thẩm mỹ và nghiên cứu
thuốc…. So với ghép da tử thi, các vật liệu này có thuận lợi lớn là không phụ
thuộc nguồn da người cho, việc sản xuất chúng gần như vô hạn và hầu như
không có nguy cơ lây nhiễm bệnh do có thể kiểm soát trước được nguồn cho
tế bào bằng các xét nghiệm tầm soát các bệnh lây truyền qua ghép mô/tế bào.
Có hai thành phần chính của vật liệu tương đương da là thành phần khuôn và
thành phần tế bào. Thành phần khuôn hay được sử dụng là collagen, acid
hyaluronic, polymer tổng hợp hoặc sinh tổng hợp. Thành phần tế bào bao gồm
các tế bào da như nguyên bào sợi, tế bào sừng là hai tế bào chủ yếu, ngoài ra
có thể có tế bào sắc tố… Đã có những sản phẩm thương mại sẵn có trên thị
trường như Epicell, Integra, Transcyte, Apligraft, Dermagraft…
1.2.2. Một số loại tế bào và vật liệu điều trị vết thương từ nuôi cấy tế bào
Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm
sàng, một số tế bào được nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là:
các yếu tố như các sợi fibrin gắn kết, các yếu tố kết dính để gắn biểu bì vào
trung bì. Vết bỏng sâu thiếu các thành phần trung bì hoặc lớp trung bì chưa
hình thành hoặc hình thành chậm. Cần thiết phải tạo ra một lớp trung bì mới
để tạo điều kiện cho da ghép tự thân hoặc tế bào sừng nuôi cấy che phủ lên
vết thương cho kết quả tối ưu nhất [40]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đều
cho rằng, vật liệu thay thế da lý tưởng nhất là phải thay thế được cả lớp
trung bì và biểu bì. Sự tương tác giữa các yếu tố thuộc lớp biểu bì và trung bì
sẽ kích thích sự trưởng thành của từng lớp. Boyce và Hansbrough đã tạo ra
vật liệu thay thế da hỗn hợp (composite subtitues) g ồm nguyên bào sợi người
nuôi cấy được cấy lên tấm màng collagenglycosaminoglycan sau đó cho tế
bào sừng phát triển lên trên, vật liệu này đã được thử nghiệm thành công trên
mô hình chuột, nhưng còn một số hạn chế khi thử nghiệm lâm sàng. Một xu
hướng khác, đơn giản hơn và không đòi hỏi cao về công nghệ đó là sử dụng
fibroblasts nuôi cấy đưa lên vết thương. Nguyên bào sợi sẽ tổng hợp các
thành phần của trung bì, tạo điều kiện cho việc ghép da tự thân hoặc cấy
ghép tế bào sừng thành công [33], [40], [70].
Để điều trị bỏng sâu, cả lớp biểu bì và lớp trung bì của da cần được thay
thế, việc điều trị bằng tấm tế bào biểu bì đơn thuần sẽ dẫn đến chất lượng
liền vết thương thấp. Tương phản với tấm biểu bì nuôi cấy, các cấu trúc
trung bì từ công nghệ có thể dự phòng co kéo vết thương và tạo ra tính bền
vững cơ học tốt hơn. Vật liệu tương đương trung bì và biểu bì phải được
ghép kế tiếp nhau việc làm cho tuần hoàn hóa trung bì tốt sau khi loại bỏ nền
vết thương là cần thiết trước khi ghép lớp biểu bì [35]. Một số vật liệu này là
mảnh ghép đồng loại đã được xử lý bằng hóa chất, ví dụ Alloderm không có
thành phần tế bào gây ra đáp ứng miễn dịch thải ghép [77]. Ngược lại,
Dermagraft lại có các nguyên bào sợi từ da bao quy đầu của người được nuôi
cấy trên lưới polyglactin có khả năng giáng hóa [72]. Trong các vật liệu này,
các tế bào tiết protein đệm gian bào, hàng loạt các yếu tố tăng trưởng và
thương cấp tính trên người [26].
Các nghiên cứu gần đây gợi ý rằng, MSC có khả năng tiết ra nhiều
cytokin và các chất hóa ứng động khác nhau vốn có vai trò quan trọng cho hoạt
động sửa chữa mô, thậm chí trên cả các mô hình tổn thương thận và não [73].
MSC làm nhanh quá trình liền vết thương là do ít nhất có 2 cách thức khác
nhau bao gồm thông qua tăng biệt hóa tế bào và thông qua các tín hiệu ngoại
lai. Các MSC tủy xương đã được báo cáo là có thể biệt hóa thành tế bào sừng
trong các nghiên cứu có sử dụng EGFP [82]. Trong các vết thương này, một
phần trăm các tế bào có biểu hiện EGFP dương tính ở cả trung bì và biểu bì
cũng có biểu hiện với keratin vốn là marker chuyên biệt của tế bào sừng. Tuy
nhiên, với tỷ lệ được đưa ra là quá thấp nên MSC vẫn chưa được coi chắc
chắn là có trách nhiệm đối với quá trình sửa chữa mô thông qua tăng biệt hóa
chuyển dạng và tái sinh hoặc phá hủy mô [58], [82]. Những chứng cớ tích cực
hơn cũng đã cho thấy, MSC có thể thúc đẩy liền vết thương thông qua các tín
hiệu ngoại lai được tiết ra mà cải thiện các đáp ứng với tổn thương của các
tế bào da cư trú tại đó. Các báo cáo gần đây bắt đầu xác định những tương tác
ngoại lai này giữa MSC và các dạng tế bào chuyên biệt khác trong vết thương
da [15], [22], [81]. Khi nghiên cứu các vết thương được điều trị bằng dịch nổi
nuôi cấy MSC (dịch chiết ngoại bào MSC), các tác giả nhận thấy dịch chiết
ngoại bào MSC đã làm vết thương nhanh đóng kín và nó tăng hấp dẫn với các
đại thực bào và các tế bào nội mô đầu dòng thâm nhập đến vết thương [22]
và các thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng dịch ngoại bào MSC cũng thúc đẩy tế
bào sừng và tế bào nội mô tăng sinh. Hơn nữa, MSC tủy xương còn tiết ra các
chất hóa ứng động với đại thực bào, tế bào sừng và các tế bào nội mô. Các
quan sát này rõ ràng chỉ ra rằng MSC tủy xương là một nguồn các tín hiệu
ngoại lai có tác dụng điều khiển các đáp ứng tế bào quan trọng trong sửa chữa
vết thương da.
Do đó, một trong những hướng nghiên cứu khác trong điều trị vết
thương diện tích rộng, do cơ thể bị suy yếu… thì hậu quả là gây ra những vết
thương vết loét lâu lành, thậm chí không liền được. Do đó công nghệ tế bào
gốc đang mang lại những hy vọng lớn trong việc khắc ph ục nh ững nan gi ải
hiện nay trong liền vết thương.
Những tế bào gốc phôi có tiềm năng lớn thay thế toàn bộ các tế bào chức
năng của cơ thể. Nhưng việc sử dụng tế bào gốc phôi vào lĩnh vực liền vết
thương hay bất cứ lĩnh vực nào khác đang gặp phải những vấn đề về đạo đức,
cần có nguồn thay thế. Hơn nữa, một báo cáo gần đây cho thấy tế bào gốc phôi
của người trong nuôi cấy có biểu hiện protein không phải của người và giả
thiết đặt ra là có thể từ protein chuột từ fibroblasts chuột của lớp nuôi (feeder
layer), do đó tính an toàn của tế bào gốc phôi còn phải tiếp tục nghiên cứu [51].
Một số nguồn tế bào gốc khác nhau từ máu cuống rốn, tế bào gốc máu
ngoại vi và tuỷ xương cũng đang được nghiên cứu [19], [32], [37], [75]. Một
nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ bFGF và
VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xương cao hơn rất nhiều so với fibroblasts
trung bì. Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xương tại chỗ vết
thương để thúc đẩy liền vết thương.
Một nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ
bFGF và VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xương cao hơn rất nhiều so v ới
fibroblasts trung bì. Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xương tại
chỗ vết thương để thúc đẩy liền vết thương [32].
Tuy nhiên có tác dụng liền vết thương vết bỏng nhưng các nguồn tế
bào gốc từ các mô của cơ thể như máu tuỷ xương, máu ngoại vi, máu cuống
rốn, não, mỡ, gan… đều rất hạn chế về số lượng nên tính ứng dụng chưa cao.
Trong khi đó, khai thác các nguồn tế bào gốc trung mô trưởng thành cũng đang
là một trong những hướng nghiên cứu điều trị vết thương. Ngoại trừ các
trường hợp ghép tế bào gốc trung mô đồng loại vốn sẵn có nguồn tế bào rất
trẻ như tế bào gốc trung mô từ màng ối, dây rốn và máu cuống rốn thì đối với
sẵn có với số lượng lớn và dễ dàng thu hồi mà ít gây những bất lợi cho bệnh
nhân nên tế bào gốc mô mỡ có thể sẽ là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học
tái tạo trong tương lai đặc biệt các trường hợp sử dụng ghép tự thân. Các nhà
nghiên cứu đề xuất nhiều cách thức phân lập tế bào gốc mô mỡ khác nhau, có
tác giả phân lập theo cách kinh điển là nuôi mô mỡ trong đĩa nhựa có môi
trường dinh dưỡng và chờ cho tế bào tự mọc từ các mẩu mô ra và thu các tế
bào có hình sao hoặc hình thoi là tế bào gốc trung mô. Có tác giả lại dùng
collagenase để phá hủy cấu trúc mô sau đó ly tâm lọc lấy các tế bào. Môi
trường nuôi cấy cũng được công bố theo nhiều công thức khác nhau, các tác
giả dùng môi trường cơ bản khác nhau như DMEM, DMEMF12,
Copyright: Tài liệu đại học ©