1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Trong thập niên của những năm 1880 mở ra kỷ nguyên của cây
trồng chuyển gen khi con người đã phát hiện ra khả năng chuyển
gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống
trong đất, trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ
đặc biệt để chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra
những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn.
Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào
song kỹ thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng dãi là nhờ những ưu điểm
sau.
•
Không đòi hỏi dụng cụ đặc biệt
•
Số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu
•
Dễ thao tác invitro, dễ làm
•
Đây là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp

1.1 Hoạt động của Agrobacterium tumefaciens
Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào
những vị trí tổn thương trên cây hai lá mầm và gây ra khối u tại
những vị trí tổn thương đó.
Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành
các chất độc có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl
acetosyringon). Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết
hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích

loại vi khuẩn thông thường khác là đều chứa các plasmid (một dạng
DNA vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng nhân bản
độc lập).
Chắc chắn plasmid này đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất
di truyền gây bệnh u cho cây, do vậy người ta gọi chúng là Ti-plasmid
(Tumor inducing plasmid). Ti-plasmid đã chuyển một đoạn DNA của
Ti-plasmid nhập vào gen của cây.
Ti-plasmid là một plasmid lớn với kích thước khoảng 200kb. Trên
Ti-plasmid có đoạn T-DNA (tumor DNA) được giới hạn bằng bờ phải
(right border) và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và
bờ trái tương tự nhau. T-DNA là một đoạn có kích thước 25kb chứa
các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ được chuyển vào tế bào thực
vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây ra bệnh u.

LB
RB
vir
ori
A
B
G
C
D
E
Các gen gây
đồng hoá
opine
Các gen gây u và
tổng hợp opine
T-DNA

việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid tách
dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium.
Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị
phục vụ việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác
hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo
giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector
liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ
chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa
plasmid trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5)
nên vector này ít được sử dụng

•
b. Hệ thống vector kép
Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai
vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong
Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ E.coli trong đó có
thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ
thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid
cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt
bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ.
Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của
vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu.

1.4 Kỹ thuật đĩa lá (Leaf disk technique)
Để thực hiện việc chuyển gen nhờ vi khuẩn người ta sử
dụng kỹ thuật đĩa lá. Tạo các đĩa lá của thực vật cần chuyển gen
sau đó xử lý các đĩa lá trong dung dịch vi khuẩn A.tumefaciens
mang các plasmid chứa gen mong muốn đã được thiết kế lại
trong vài chục phút, trong dung dịch có bổ sung acetosyringone
để tăng cường khả năng hoạt hoá gen vùng vir qua đó thúc đẩy