ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

NGUYỄN THANH HUYỀN

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL
VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM
GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

NGUYỄN THANH HUYỀN

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL
VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM
GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ
bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ mã số
B2016-TNA-24.
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Thanh Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 3

2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 36
3.1. Định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng HPLC ................... 36
3.2. Định lượng sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp
polyphenol ở chè ................................................................................ 38
3.3. Mối liên quan giữa hàm lượng catechins với sự biểu hiện của gen LAR
và ANR ở chè trung du xanh và chè trung du tím ................................ 45
KẾT LUẬN ................................................................................................. 48
KIẾN NGHỊ................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABTS:

2,2'-azinobis(3-ethylebenzothiaziline-6-sulfonate)

ANR:

Anthocyanidin reductase

BHA:


EGC:

Epigallocatechin

EGCG:

epigallocatechin gallat

GC:

Gallocatechin

LAR:

Leucoanthocyanidin reductase

RNA:

Axit ribonucleic

PAL:

phenylalanine ammonialyaza

Đtg:

Đồng tác giả

HPLC:




vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol ........... 8
Hình 1.2: Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol............................................ 9
Hình 1.3. Các con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè ............................ 16
Hình 1.4. Các dẫn xuất của catechins……………………………………….18
Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp catechin ở chè……………………………………21
Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC tại 280 nm (A) và phổ ESI-MS negative của 5
chất chuẩn C (1), GC (2), EGC (3), EGCG (4), ECG (5) (B-F). ... 36
Hình 3.2. Sắc ký đồ UV 280nm của 05 chất chuẩn (A) và 08 mẫu thí nghiệm . 37
Hình 3.3. Đồ thị khuếch đại của các gen trong phản ứng real-time. .............. 41
Hình 3.4. Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại trong các ống
phản ứng....................................................................................... 43
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen LAR, ANR trong hai
mẫu chè tím và chè xanh. CT: chè tím, CX: chè xanh................... 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây chè (Camellia sinensis O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu

2

Mặt khác, chất lượng của sản phẩm chè ngoài phụ thuộc vào công nghệ
chế biến còn chịu ảnh hưởng rất lớn bởi chất lượng nguyên liệu sử dụng. Có
khoảng 120 – 130 hoạt chất khác nhau trong cây chè và chúng sắp xếp thành
các nhóm sau: nhóm đường; nhóm pectin; nhóm tinh dầu; protein và axit
amin; các sắc tố; các chất vô cơ; vitamin; các enzyme; chất nhựa; các chất
hữu cơ; các hợp chất thứ cấp (polyphenol, tannin, cafein….). Trong đó hàm
lượng polyphenol, sẽ quyết định đến chất lượng của sản phẩm chè [6]. Có rất
nhiều các hợp chất polyphenol được tìm thấy ở chè, cả polyphenol đơn giản
và polyphenol phức tạp, trong đó flavonoid là thành phần polyphenol chủ yếu
được tổng hợp từ các polyphenol đơn giản [9]. Các thành phần hàm lượng
polyphenol này lại thay đổi rất lớn theo giống và chất lượng nguyên liệu. Vì
vậy việc nghiên cứu, điều tra tìm ra những vùng chè, giống chè có hàm lượng
và chất lượng polyphenol ưu việt để định hướng khai thác một cách có hiệu
quả nguồn nguyên liệu phong phú này vào mục đích phục vụ sức khỏe cộng
đồng là một hướng nghiên cứu mới, cần thiết và có nhiều triển vọng.
Việt Nam là một trong những quốc gia có diện tích trồng chè lớn, có
nhiều vùng chè với các đặc điểm sinh thái đặc trưng, trồng nhiều giống chè
khác nhau. Trong đó, giống chè Trung du từ lâu đã được coi là khởi thủy của
cây chè Việt Nam, có khả năng chịu bệnh, chịu hạn, sinh trưởng mạnh, giá trị
kinh tế cao, bảo vệ môi trường sinh thái. Tuy nhiên do đã được trồng nhiều
năm nên dần bị thoái hóa năng suất và chất lượng thấp [2][10] cần bảo tồn và
nghiên cứu để phục vụ các lợi ích của cây chè đặc biệt là khả năng chữa bệnh.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Định
lượng một số hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme
tham gia tổng hợp polyphenol ở chè”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Định lượng một số hợp chất polyphenol ở các giống chè trồng tại Thái
Nguyên và nghiên cứu mối liên quan với sự biểu hiện của gen từ giống chè

diện tích đất theo qui hoạch để trồng chè rất lớn (trên 200.000 ha); điều kiện
khí hậu rất phù hợp cho cây chè phát triển: lắm nắng, mưa nhiều - lượng nước
mưa trung bình 1700 - 2000mm/ năm, độ ẩm không khí 80 -85%, - nhiệt độ
trung bình 21 - 22,60C; đất trồng chè gồm hai loại là phiến thạch sét và bazan
màu mỡ … Ngày nay, ở hầu hết các tỉnh có điều kiện thuận lợi đều trồng chè,
song ba vùng trồng nhiều nhất là:
- Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái)
chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc.
- Vùng trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên). Đây là
vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy
sản xuất lớn.
- Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ
yếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô long.
Trong đó vùng chè Thái Nguyên là vùng có sản lượng chè lớn thứ 2
trong cả nước và rất nổi tiếng với sản phẩm chè đặc sản Tân Cương. Thái
Nguyên hiện có 16746 ha chè, trồng chủ yếu là các giống Trung du
(TDLX, LDP1).
Về phân loại khoa học cây chè được thể hiện trong bảng 1.1:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


5

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của cây chè [14]
Phân loại khoa học
Giới

Plantee

trưởng.
Chồi: mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh
dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả.
Lá: lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng
cưa, chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm.
Hoa: hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,
có khi lại hơi phớt hồng.
Quả: quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả chè có dạng hình
tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt.
Hạt: hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu
nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


6

Hệ rễ: gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu
đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà [2].
- Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè: Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự
sinh trưởng và phát triển của chè là 22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối
thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy
từng giống chè. Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước
ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %[3].
- Sinh trưởng và phát triển của cây chè: Sự phát triển của cây chè chia làm
hai chu kỳ: chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy
mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh
trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm[2][3].
1.1.3. Thành phần hóa học của chè


18-36%

Flavan-3-ols (Catechin)

12-24%

Flavonol và glycosides

3-4%

Anthocyanins và Leucoanthocyanidin

2-3%

Phenolic

~ 5%

1.1.4. Tác dụng sinh học của cây chè
Nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước, cho thấy chè
xanh mang lại nhiều tác dụng nhờ thành phần hóa học đa dạng với các chất hỗ
trợ sức khỏe và phòng chống bệnh tật.
Theo Ts. Ngô Đức Phương, nguyên cán bộ Khoa Tài nguyên- Dược liệu,
viện Dược liệu đã đưa ra kết quả. Về dược lý học chè có vị đắng chát, tính
mát, có tác dụng thanh nhiệt giải khát, tiêu cơm, lợi tiểu, da thịt mát mẻ, bớt
mụn nhọt và cầm tả lị. Do có cafein và theophyllin, chè xanh được xem là
một chất kích thích não, làm tăng hô hấp, tăng cường và điều hoà nhịp đập
của tim[16].
Thành phần catechins có trong chè xanh đã được nghiên cứu chứng minh

có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất antioxidant.

Hình 1.1. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol[11]
Cơ chế chống oxy hóa của chè thuộc cơ chế chống oxy hóa của các hợp
chất phenol. Tính chống oxy hóa của các ankylphenol thể hiện ở chỗ chúng có
khả năng vô hiệu hóa các gốc peroxyt, do đó nó có thể cắt mạch oxy hóa. Sản
phẩm đầu tiên xuất hiện là các gốc phenol tạo thành do nguyên tử hydro của
nhóm hydroxyl được nhường cho gốc peroxyt:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


9

Hình 1.2: Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol[11]
Các gốc phenol rất ổn định, kém hoạt tính, nhờ vậy chúng không có khả
năng sinh mạch oxy hóa tiếp theo. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất
ankylphenol được tăng lên bằng cách hydroxyl hóa và phân tử phenol, vì các
hợp chất polyphenol có hoạt tính tốt hơn monophenol. Chúng có một số tính
chất sau:
Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do, chuyển thành dạng
oxy hóa:

Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và như
vậy chúng có khả năng phản ứng với hai gốc tự do nữa:

Đặc biệt dạng oxy hóa và dạng khử của chúng có thể tương tác với nhau
thuận nghịch tạo gốc Semiquinon:

nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt phenol thành các nhóm sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


11

Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vòng benzen và
1 hay nhiều nhóm OH, được phân thành các: mono phenol; di phenol
(pyrocatechin, rezoxyn...); tri phenol (pyrogalon, oxy hydroquinon...).
Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo,
ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm:
monome và polymer .
- Monome (hay polyphenol đơn giản) được chia thành:
+ Nhóm C6 - C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm
nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm.
+ Nhóm C6 - C3 (axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl được nối với
nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao.
+ Nhóm C6 - C3 - C6: gọi là các Flavonoid và được chia thành các nhóm
phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), anthocyanidin (sắc tố xanh, đỏvà tím),
catechin (không màu)...
- Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ
như Tanin, Lignin, Axit Humic….[15].
Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực
vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng; vào
các quá trình trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô
hấp tế bào (vận chuyển H

+

Flavonol,

Flavanon,

Flavanonol,

Catechins,

Leucoanthocyanidin, Anthocyanidin, Chalcon, Auron.
- Catechins là hợp chất Flavonoid phổ biến trong thiên nhiên và có nhiều
trong quả và lá chè.
- Ngoài ra còn có các dẫn xuất:
+ IsoFlavonoid (vòng B nối với vòng C ở vị trí C3)
+ NeoFlavonoid (vòng B nối với vòng C ở vị trí C4)
+ BiFlavonoid (2 phân tử Flavonoid liên kết với nhau)[36].
Các công trình nghiên cứu đã cho biết thành phần Flavonoid trong lá chè
xanh chủ yếu là:
- Các dẫn xuất của catechins: catechin, epigallocatechin, gallocatechin,
epigallocatechin gallat, epicatechin, epicatechin gallat…
- Các chất flavonol: Quercetin, Kaempferol, Myricetin và các dẫn xuất
khác của flavonol
- Theaflavin và diosmin: Theaflavin sản phẩm của sự oxy hóa đồng thời
epigallocatechingalat và epigallocatechin[23].
Còn các Flavonoid trong chè đen chủ yếu là Theaflavin và Thearubigin.
Thearubigin là nhóm sản phẩm oxy hóa đã bị polymer hóa của catechins và
các hợp chất gallat của nó [31].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


14

- Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm: Tác dụng chống viêm nhiễm
và kháng khuẩn của Flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế
giới chứng minh. Một số tác giả nghiên cứu tác dụng của 24 anthoxyanin,
leucoanthoxyanin và axit phenolic lên Salmonella (vi khuẩn thương hàn) và
thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này đều có khả năng kìm
hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza. Tác dụng
kháng virut của Flavonoid cũng đã được khẳng định; Chang-Qi Hu và cộng
sự đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35
Flavonoid chiết xuất từ thực vật và tổng hợp - đã thấy rằng các hợp chất có
nối đôi ở vị trí C2 = C3 và có nhóm OH ở C6 và C4 thể hiện hoạt tính cao hơn
các Orthodiphenol[22][24].
- Tác dụng đối với ung thư: Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung
thư của chè và các hợp chất catechins được nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Khi
tiến hành nghiên cứu in vivo, nhiều công trình công bố đã cho thấy chè và các
chất trích ly từ chè như EGCG, EGC, ECG… của chè có khả năng tương tác,
ngăn chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển của tế bào
ung thư. Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechins trung hòa các tác
nhân bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, tác nhân này có khả năng
tương tác làm thay đổi cấu trúc của DNA, ngăn chặn sự tạo thành
nitrosamine, một nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, các amine dị
vòng trong thịt, cá nấu chín, các tác nhân được cho là có thể gây ung thư. Các
thử nghiệm in vivo cho thấy khả năng tương tác trực tiếp và tăng cường hiệu
quả của EGCG, EC vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


16

Phenylalanine
PAL

Cinnamic acid
C4H

4-Coumaric acid
4CL

3X Malony CoA
4-Coumaroyl coA
Con đường phenypropanoid
CHS

Chalcone

Con đường flavonoid

CHI

Flavanones
F3’5’H


Anthocyanins

Hình 1.3. Các con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè [36]
Chú thích: ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase);
4CL (4-coumarate : CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI
(chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol
reductase);

F3H

(flavanone

3β-hydroxylase);

F3′H

(flavonoid

3′-

hydroxylase); F3′5′H (flavonoid 3′5′-hydroxylase); FLS (flavonol synthase);
LAR (leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase);
UFGT (UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyl transferase).
1.2.3. Thành phần catechins ở chè
Theo thống kê của Harbowy (1997), thành phần hóa học chính trong
chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, chiếm 30 - 40% trọng lượng
[22]; thành phần các chất hóa học trong chè đen giống với chè xanh [16].
Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp
phần tạo hương vị của chè. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe con
người đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè [22].