ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––

TRƯƠNG MẠNH TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ
ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI
HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––

TRƯƠNG MẠNH TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ
ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI
HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy


dục sinh học làm chủ nhiệm.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả

Trương Mạnh Tiến


MỤC LỤC
Lời cam đoan ........................................................................................................ i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt......................................................................................... iv
Danh mục các bảng.............................................................................................. v
Danh mục các hình ............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài .............................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................3
1.1. Cây Bảy lá một hoa ......................................................................................3
1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại............................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa ........................................4
1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa.........................................................5
1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa...........................................................6
1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ......................................................9
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu .................................................9
1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử ........................................................12
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................22
2.1. Vật liệu........................................................................................................22
2.1.1. Vật liệu thực vật.......................................................................................22
2.1.2. Vật liệu nhân gen matK, ITS....................................................................22


:

Deoxyribose nucleic acid

đtg

:

Đồng tác giả

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

kb

:

Kilobase

matK

:

Maturase K

NCBI

Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR.....22
Bảng 3.1. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
tại Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK ................33
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
tại Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS ..................35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa ........................4
Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam .............................8
Hình 1.3. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS.........................................15
Hình 2.1. Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn ..............22
Hình 3.1. Hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng
Sơn trồng trong vườn trường Đại học Sư phạm ..............................26
Hình 3.2. Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa ....................28
Hình 3.3. Hình ảnh giải phẫu thân cây Bảy lá một hoa...................................29
Hình 3.4. Hình ảnh giải phẫu rễ cây Bảy lá một hoa.......................................30
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1% ......31
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK
từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn...........31
Hình 3.7. Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI.................32
Hình 3.8. Trình tự đoạn gen matK của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
......32
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK
của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn
............33

tạo quả vào khoảng tháng 7-11 sau đó lụi đi, thời gian ủ đông của cây khá lâu.
Các loài trong chi Paris khá đa dạng và có sự tương đồng cao về hình thái.
Năm 2016, Nguyen Quynh Nga và đtg đã được thiết lập khóa phân loại bằng
việc mô tả hình thái, giải phẫu của 8 loài (species) và 2 thứ (varieties) ở Việt
Nam [43].
Có thể nhận diện thực vật bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các
phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình
thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu này đã thành công trên
một số đối tượng cây trồng như Hà thủ ô đỏ [9], Sóng rắn [28], Phong lữ thảo
[6]… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như cây
không còn nguyên vẹn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loại
phương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử. Trong đó, mã vạch DNA
được lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới. Một số mã vạch
DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược
liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong
lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây
trồng [37],… Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự ITS15.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều trong định danh thực vật.
Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các loài thực vật dựa trên trình tự
vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai [18], hay các các chi Erica
[45], Scrophularia [48], Potamogeto [55] và nhiều thực vật khác là minh chứng
cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng [34], [53]…
Huyện Bắc Sơn là huyện miền núi của tỉnh Lạng Sơn, thuộc vùng Đông
Bắc Việt Nam. Phía Tây của huyện Bắc Sơn giáp huyện Võ Nhai của tỉnh Thái
Nguyên. Ở đây có nhiều núi cao từ 500 m đến hơn 1000 m so với mặt nước

(2) Thực vật chí Trung Quốc (năm 2000) đã mô tả hình thái và xếp chi
Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài (species) và 16 thứ (variety-var.)
trong đó có 12 loài đặc hữu [40].
(3) Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III - Angiosperm Phylogeny
Group - (năm 2009) dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Paris (chi
Trọng lâu) được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) với tổng số 26 loài
và 13 thứ [56].
Chi Paris phân bố chủ yếu ở châu Âu và châu Á, đặc biệt tập trung nhiều
ở Trung Quốc. Theo tạp chí “Flora of China” (2000), chi Paris được mô tả gồm
22 loài với nhiều thứ khác nhau.
Trong chi Paris, Paris polyphylla Smith là loài được tìm thấy sớm nhất
(năm 1813). Loài này hiện được công bố chi tiết có tới 10 thứ [40].
Mười thứ (variety) thuộc chi Paris gồm:
1) Paris polyphylla var polyphylla (tên tương ứng Daiwa polyphylla Sm.);
2) Paris polyphylla var yunanensis;
3) Paris polyphylla var chinensis;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


4) Paris polyphylla var nana;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


5) Paris polyphylla var alba;
6) Paris polyphylla var stenophylla;


Thân cỏ là phần thân nằm trên mặt đất, thường lụi đi vào cuối thu. Kiểu
thân cỏ sẽ không có cấu tạo thứ cấp [17]. Thân cỏ của cây Bảy lá một hoa cao
hàng chục cm đến hàng trăm cm (Paris dunniana cao 1,5-3 m). Thân cỏ thon
dài, trơn nhẵn, mọng nước, không có cành, phía gốc có một số lá thoái hoá
thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng khoảng 3 đến 12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


lá, đa số các loài có từ 4 đến 6 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình
mác, hình trứng, bầu dục… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt
trên màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn [40].
Mỗi cây chỉ có một hoa mọc trên đỉnh cây. Mỗi hoa đều có cuống dài
hàng chục cm. Hoa có đầy đủ các phần đài, tràng, nhị, nhụy.
Quả của cây Bảy lá một hoa là quả đơn, có một mầu duy nhất. Vỏ quả
màu xanh, khi quả chín vỏ có màu xám- đen. Quả chín sẽ tự mở vỏ để cho hạt
thoát ra ngoài. Hạt của cây bảy lá một hoa thuộc kiểu hạt có nội nhũ. Hạt gồm
có vỏ màu đỏ bao bọc phôi và nội nhũ (hình 1.1 d). Về mặt lý thuyết, ở những
hạt kiểu này, phôi thường nhỏ, đôi khi còn chưa có sự phân hóa hoàn toàn [17].
Thân củ là phần nằm dưới mặt đất. Thân củ của cây Bảy lá một hoa có
chứa chất dự trữ để cây sử dụng khi ra hoa, tạo quả, mọc chồi [17]. Thân củ
phình to, thường nằm ngang, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu
xám đen. Trên thân củ có những mắt mang các sẹo của lá thoái hóa, trong nách
các sẹo đó có các chồi nách.
Cây Bảy lá một hoa có kiểu rễ của “cây có rễ phụ” [17]. Rễ phụ mục ra
từ thân củ. Các rễ tương đối đồng đều về kích thước, thường màu nâu và có
hình trụ.

uống 3 g với nước, ngày uống 2 lần.
Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho thấy các thành phần trong
cây Bảy lá một hoa có Saponin được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh ung thư
[38], [41], chống các chất oxy hóa [49]. Cơ chế chống ung thư của các dược
chất trong cây Bảy lá một hoa còn chưa rõ ràng, tuy nhiên theo hướng các
saponin kích thích tế bào chết theo chương trình (apoptosis) [41]. Bên cạnh
saponin là dược chất quan trọng, trong thân rễ của cây Bảy lá một hoa người ta
cũng phát hiện thấy 1 glucoside được gọi là paristaphin. Khi thuỷ phân
paristaphin sẽ cho glucose và một glucoside mới gọi là paridin, thuỷ phân
paridin, ta lại được glucose và một chất nhựa gọi là paridol [12].
1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa
Cây Bảy lá một hoa có những đòi hỏi riêng biệt về điều kiện sống. Theo
đó, kết quả nghiên cứu cho thấy đa số các loài được phát hiện mọc hoang ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


những khe núi ẩm ướt, có độ cao so với mặt nước biển hàng trăm mét và ưa
bóng. Ngoài ra, cây còn mọc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn, cây không chịu được úng. Phần thân trên mặt đất lụi đi hàng năm,
thường vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa đông và
mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn
mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phương
thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Theo đó, hàng năm vào
khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươm
hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có một hoa,
mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao , tuy nhiên
đây vẫn là hình thức chính để cây tái sinh trong tự nhiên. Thân rễ Bảy lá
một hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng. Thời

Tên Việt Nam

Phân hạng theo
IUCN, 1994

Trọng lâu lá dài
Củ rắn cắn, Bảy
lá một hoa

3

Paris hainanensis Merr

Trọng lâu hải
nam

4

Paris polyphylla Smith

Bảy lá một hoa

5

Paris yunnanensis Franch.

Trọng lâu vân
nam

6


http://lrc.tnu.edu.vn


A

E

P. fargesii [25EB]

F

C

PF. vietnamensis [52D]

G

G

Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam
(Hình ảnh thuộc sản phẩm của nhóm nghiên cứu, trong nhiệm vụ quỹ GEN
cấp bộ giai đoạn 2016-2019)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn


Cây Bảy lá một hoa được tìm thấy ở một số tỉnh thành của Việt Nam như

phẫu gỗ của H Lecomte và sau khi miền Bắc được giải phóng năm 1954 thì
việc nghiên cứu và giảng dạy hình thái giải phẫu được chú ý nhiều ở các trường
phổ thông và đại học. Hiện nay ngày càng có nhiều công trình đi sâu tìm hiểu
về hình thái và giải phẫu của các loài thực vật, nhất là những loài thực vật có
giá trị làm thuốc và những loài suy giảm nghiêm trọng về số lượng, cần được
bảo tồn.
Năm 2015, trong “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài Hà
thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam” của Phạm
Thanh Huyền và đtg đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu khóa
phân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa học của
các mẫu Hà thủ ô đỏ [9]. Theo đó, nghiên cứu trên 37 mẫu Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson thu tại 10 địa điểm thuộc 8 tỉnh thành,
nhóm nghiên cứu đã xác định được ở Việt Nam hiện có 3 thứ của loài Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson gồm: F. multiflora var. multiflora (Thunb.)
Haraldson; F. mutiflora var. angulata (S.Y. Liu) H. J. Yan, Z. J. Fang & S. X.
Yu và F. multiflora var. ciliinervis (Nakai) Yonek. & H.Ohashi. Nghiên cứu về
hình thái đã giúp các tác giả xây dựng được khóa phân loại cho các thứ của loài
này ở Việt Nam. Đã mô tả được chi tiết đặc điểm hình thái loài Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson, cũng như các thứ của loài, cùng với đặc điểm
giải phẫu các bộ phận rễ, thân, lá. Kết quả thu được là những dẫn liệu bổ sung
cho các tài liệu trong nước về loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson,
đồng thời đây cũng là dẫn liệu khoa học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và
phát triển loài Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson để tạo
nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc ở Việt Nam [9].
Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Phong lữ thảo (Pelargonium
hortorum L. H. Bailey) của Tạ Lê Mai Hậu và đtg (2016) lần đầu tiên đã mô tả
đầy đủ các đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu của loài Phong lữ thảo ở Việt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn



http://lrc.tnu.edu.vn


Bảy lá một hoa (Paris) cũng là loài được các nhà nghiên cứu quan tâm
và có các công trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái giải phẫu, giúp bước đầu
phân biệt các loài trong chi Paris. Phải kể đến đầu tiên là bộ sách “Cây cỏ Việt
Nam” năm 1999 của Phạm Hoàng Hộ đã có những mô tả sơ bộ về hình thái của
một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam bằng hình vẽ [7]. Đến năm 2016, với đề
tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt
Nam” đã mô tả chi tiết đặc điểm cấu tạo giải phẫu của các bộ phận thân khí
sinh, lá, thân rễ, rễ, và bột của thân rễ bảy lá một hoa. Đây là báo cáo lần đầu
tiên về cấu tạo giải phẫu của cây Bảy lá một hoa - Paris chinensis Franch [22].
Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dũng và đtg (2018) về loài Bảy lá một hoa Việt
Nam - Paris vietnamensis (Takht.) H.Li đã xác định được điểm đặc trưng giúp
phân biệt với các loài khác thuộc chi Paris là nhị có trung đới kéo dài hình trụ
ngắn 1 - 1,5mm; cánh hoa dài hơn đài 1,2 - 2 lần; lát cắt ngang qua bầu hình
sao, cánh bầu lõm sâu, nhụy có vòi nhụy (phần hợp) rất ngắn; hạt có áo hạt màu
đỏ [3]. Đặc biệt trong nghiên cứu của Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) đã mô
tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa định loại cho 8 loài và 2 thứ thuộc chi
Paris ở Việt Nam [43].
1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành
và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên
các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của
chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa
chọn các gen khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen để làm căn
cứ phân loại sinh vật [35].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Gen matK nằm trong hệ gen lục lạp, có chiều dài hơn 150000 bp, mã hóa
cho maturase K- là những enzyme có kích thước khoảng 498-515 amino acid
(bảng 1.2) [60].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

http://lrc.tnu.edu.vn