
 



THÌA
CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM


 - 2014







CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM






 MC LC
DANH MC CÁC BNG
DANH MC CÁC HÌNH
DANH MC CÁC CH VIT TT
T V 1
 TNG QUAN 3
1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 3
1.1.1. V thc vt 3
1.1.2. V ng di truyn 4
1.1.3. V thành phn hoá hc 5
1.1.4. V tác dng sinh hc 9
1.2. TNG QUAN V U 11
1.2.1. Nghiên cm di truyn 11
1.2.2. áp vân tay sc ký 13
1.2.3. ng dc ký lp mng hi
(HPTLC) 15
 NG VÀ U 17
2.1. NGUYÊN VT LIU NGHIÊN CU 17
2.1.1. Mu nghiên cu 17
2.1.2. Dung môi, hóa cht 17
2.1.3. Máy móc, thit b 18
2.2. U 19
2.2.1. Nghiên cm hình thái 19
2.2.2. Nghiên cng di truyn 20
2.2.3. Vân tay sc ký Gymnema latifolium Wall. ex Wight 22
2.2.4. ng bc ký lp mng hi

4.4.1. V thng Gymnemagenin b
pháp HPTLC 49
4.4.2. V kt qu ng 50
4.5. V TÍNH MI C TÀI 52
KT LUN 54
KIN NGH 55
TÀI LIU THAM KHO 56
DANH MC CÁC BNG

Bng 1.1
Cu to ca acid gymnemic A  D
6
Bng 2.1
V u trong nghiên cu
17
Bng 2.2
m hình thái mô t các mu G.latifolium Wall. ex
Wight
19
Bng 2.3
Các thành phn ca phn ng PCR
21
Bng 2.4
Các dãy n ca dung dch mu chun (mg/ml)
24
Bng 3.1


Kt qu ng Gymnemagenin b
pháp HPTLC
43 DANH MC CÁC HÌNH

Hình 1.1
Cu to acid gymnemic A
1
, A
2
, A
3
và A
4

6
Hình 1.2
Cu trúc ca các acid gymnemic phân l c t
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h
ng huyng
7, 8
Hình 1.3

o

29
Hình 3.4
Mu GL4 (Thái Nguyên; 21
o
- 105
o

30
Hình 3.5
Tuyên Quang; 22
o
- 105
o

31
Hình 3.6
n di sn phm tách chit ADN
33
Hình 3.7
n di sn phm ADN khui
33
Hình 3.8
     t 2 loài trong chi
Gymnema R. Br
37
Hình 3.9
    c xây dng t các mu Gymnema
latifolium Wall. ex Wight và Gymnema sylvestre (Retz) R.

Công cụ tìm kiếm đồng bộ trình tự
bp
Base pair
Cặp base nitơ
C
Cystein
Cystein
CMC
Chemistry, Manufacture and Control
Hóa học, sản xuất và kiểm soát
FDA
Food and Drug Administration
Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ
G
Guanin
Guanin
GAP
Good Agricultural Practice
Thực hành trồng trọt tốt
GC
Gas Chromatography
Sắc ký khí
GMG
Gymnemagenin
Gymnemagenin
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

R
f
Retention factor
Hệ số lưu giữ
RNase A
Ribonuclease A
Ribonuclease A
rps16
Ribosomal protein S16
Ribosomal protein S16
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SFDA
State Food and Drug Administration
Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Trung Quốc
TAE
Tris- acetat - EDTA
Tris- acetat - EDTA
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
UPGMA
Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean
Phương pháp xây dựng cây phát
sinh loài dạng có gốc
UV
Ultraviolet Radiation

có th  nhnh cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)
ng và thm chí là tii cây dây thìa canh (Gymnema
sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.). Góp phn vào vic nghiên c cây
dây thìa canh lá to  Vit Nam (Gymnema latifolium     tài
m hình thái, di truyng Gymnemagenin

2

ca loài dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Vi
c thc hin vi các mc tiêu :
 Nghiên cm hình thái ca các mu dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight) thu hái ti Vit Nam.
 Nghiên c  m di truyn phân t ca các mu dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight).
   ng Gymnemagenin có trong các mu dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight) nghiên cu.
mc. Mt cm mang rt nhing cm hoa 1-
1,5 cm, cung hoa 3-ng, ph 
chuông, nhn  mt ngoài. ng hoa có 5 cp g mang lông  hng tràng, các thùy
hình trng, khong 1,2 ×1,2 mm, ph ng trc, ngi ng
tràng [11].
Tr nh nhy dng hình tr, phn ph nh dng màng ngu núm
nhy. Khi phu núm nh i hình
mác nh-5,5×1,5-2 cm, có lôc. Ht hình trng thuôn, dài
khong 1,1 cm×5 mm, mép dng màng; mào lông dài 3 cm [11].

4

Phân bo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quc (Qu
Qung Tây, Vân Nam),  (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra,
Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [56], Vi      
Nguyên) [11].
1.1.2. V ng di truyn
m Hà Thanh Tùng  nghiên cnh s khác
bit di truyn s dng ch th phân t RAPD ca 26 mu thuc 5 loài trong chi
Gymnema u Gymnema latifolium Wall. ex Wight. Kt qu
cho thy, 3 mu  min Bc Vit Nam (Hoà Bình, Thái Nguyên và Tuyên Quang)
cùng nm trong cùng mt nhóm di truyu  gn khu vc min
Trung Vit Nam không cùng nhóm này. Kt qu cho thy s khác bit ca các mu
theo s phân b a lý [11].
 Thanh Thuý i trình t n gen ITS ca
8 mu trong chi Gymnema R.Br Kt qu nh s ng di truyn ca 2
mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight. là 0,     n trình t
CGGCCCAAA  v trí nucleotid 56 trên vùng kho sát ITS1+5.8S+ITS2 hoàn toàn
khác biGymnema latifolium Wall. ex Wight so vi trình
t  trên ngân hàng gen th gii (Genbank). Kt qu chng minh kh

gymnemic A
1
(chim 70%) và acid gymnemic A
2
(chim 30%). Walter Stocklin
(1969) thì cho rng acid gymnemic là hn hp ca 4 acid gymnemic A
1
, A
2
, A
3
và
A
4
. Khi thc hin phn 
t cu thành ca gymnemic acid gm có ph ng (tri-O-acetyl--D-
glucofururono lacton, tera-O-acetyl-D-glucuronic acid cùng m   
c cu trúc) và hn hp aglycon (gm genin G, genin J, genin K), tin hành
phn ng kic Gymnemagenin và hn hp các acid (hình
1.2) [52].

6 Hình 1.1. Cu to acid gymnemic A
1
, A
2
, A
3

A
Acid
glucuronic
G
Gymnemagenin
+
+
+
+
J
Gymnemagenin

+
+
+
B
Acid
glucuronic
K
Gymnemagenin
+

+
+
C
Acid
glucuronic
N
Gymnestrogenin


3
CH
2
OH
R
1
OO
OH
H
H
OH
OH
H
OH
H
CH
2
OH

-glucopyranosyl
O
COOH
OH
H
H
OH
H

C
CH
3
CH
3
O

Mba = 2-methylbutyroyl
CH
3
O

Ac
O

Bz
STT
Acid gymnemic
R
1
R
2
R
3
R
4
TD*
1
Acid gymnemic I
-gluA

H
0,5
6
Acid gymnemic VI
-gluA
3
- -glc
tga
H
H
0,5
7
Acid gymnemic VII
H
H
H
H
(-)**
8
Acid gymnemic VIII
-gluA
3
- -OG
mba
H
H
(-)
9
Acid gymnemic IX
-gluA

Acid gymnemic XIII
-gluA
H
H
mba
0,5
14
Acid gymnemic XIV
-gluA
H
H
tga
0,5
15
Acid gymnemic XV
H
mba
tga
H
1
Hình 1.2a. Cu trúc ca các acid gymnemic phân lc t Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h ng huyng [14].

8

STT
Acid gymnemic
R
1
R

sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h ng huyng [14].
Ti Vit Nam, th nghinh các nhóm cht có trong dây
thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ti Hòa Bình có thành
phn chính gm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, chng kh và
coumarin [6].
Trong nghiên cn phm thu n ethyl acetat
ca dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) n có pic sc
ng vi Gymnemagenin trên s (hình 1.3).

Hình 1.3. nh tính Gymnemagenin trong các n ethyl acetat
trong mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight.
a. Gymnemagenin chun.
b. n ethyl acetat ca Gymnema latifolium Wall. ex
Wight sau khi thy phân [11].

9

Mt, phân lp t n ethyl acetat ca bc liu dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium c hp chc
 nh là -acetoxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-on) và hp cht
GLHE7 (lupeol acetat) (hình 1.4) [4].
c tài liu nào trên th gii công b v các hp
chc phân lp t dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight).
12
8
7
6
9
10
5

10
5
1
2
3
23
24
29
20
30
19
21
18
11
28
15
16
AcO
13
14
4
Ac =
C
CH
3
O

a) b)
Hình 1.4. Cu trúc hoá hc ca hp cht GLHE9 (a), GLHE7(b) [4].
1.1.4. V tác dng sinh hc

khun ca dch chic và dch chit dung môi h
petroleum ether, ethanol) ca bt lá Gymnema kollimalayanum A. Ramachandran &
M. B. Wiswan thu hái ti Peninsular   trên 8 chng vi khun gram âm
(Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella paratyphi, Shigella boydi, S.
brunci, S. dysentriae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica) và 2 chng
vi khu   Cornybacterium diptheriae và Enterococus faecalis). Kt
qu c cho thy dch chic không có tác dng kháng khun. Ngoi tr
dch chit methanol không có tác dng trên Cornybacterium diptheriae và Proteus
vulgaris, các dch chit dung môi ha bt lá Gymnema kollimalayanum A.
Ramachandran & M. B. Wiswan còn lu cho tác dng. Dch chit hexan cho tác
dng kháng khun mnh nh ng kính vòng tròn kháng khun ca các dch
chiu trong khong 10  21 mm [44].
n hành
th tác dng kháng khun ca dch chit các dung môi h
methanol) ca lá Gymnema kollimalayanum A. Ramachandran & M. B. Wiswan
   i   trên 5 chng vi khun gram âm (Escherichia coli,
Psuedomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebseilla pneumoniae, Salmonella
typhi) và 3 chng vi khu   Staphylococcus aureus, Streptococci

11

pneumoniae, Bacillus subtilis). Ngoi tr dch chit acetone không có tác dng trên
chng vi khun Bacillus subtilis, các dch chit còn l u cho tác dng kháng
khung kính vòng tròn kháng khun ca các dch chiu trong
khong 7 - 11 mm [40].
1.2. TNG QUAN V U
1.2.1. Nghiên cm di truyn
1.2.1.1. Phương pháp mã hóa ADN (“ADN barcoding”) trong phân loại học
Phân loi hc ngày nay gây ra nhiu tr ngi cho các nhà khoa hc khi cn
n d lp lc chp

n Ac mã hóa ct vn trình t t trong
n. Thung b trình t c s d ng b mn trình t
At vi mn trình t Ac mã hóa ct thông
qua tìm kim d liu trình t ging nht vi trình t t [47]. Ngân hàng gen
(Genbank) cung cp công c  tìm
kim s ng b gia mt trình t t và mt trình t n
[31].
1.2.1.2. Vùng phiên mã nội của ADN Ribosom (ITS – rADN)
Nghiên cu v ADN thc vt, có 3 lo   c chn làm i
ng nghiên c     p th và ADN ty th. Trong s 
ADN nhân t ra có nhiu  trong nghiên cu phân loi thc vt bi ADN nhân
có m tic s khác bit v di truyn
ngay c gia các loài trong cùng 1 chi hay gia các cá th ca cùng mt loài. Trong
c chui ADN nhân ca t bào thc vt, khu vc nghiên cu nhiu nht là
vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã ni (internal transcribed spacer 
ITS) vi nhin lp v trình t nucleotid [10]. Riêng vùng phiên mã ni (ITS),
 gin 2900 trình t này ca
các loài thc vt ht kín [27]. Mt kho sát ca Álvarez và Wendel (2003) thy rng
khong 1/3 (34%) các nghiên cu công b v phát sinh loài (phylogenetic analyses)
 da trên duy nht trình t ITS [15].
Cu trúc ca ITS  nh nm trong vùng 18S  26S ADN
ribosome nhân, gm 3 phn: ti 5.8S  trình t có tính bo tn cao trong
tin hóa và 2 vùng phiên mã ni ITS 1 và ITS 2 [17].  dài trình t phn ti
v 5.8S g dài vùng phiên

13

mã ni ITS có s n 252
bp). Toàn b vùng ITS  thc v i 700 bp [17].


c ký [63].
1.2.2.2. Phương pháp vân tay sắc ký dựa vào kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao (HPTLC)
Sc ký lp m       c s
d c lin, nhanh gn và kinh t
pháp phân tích dt s hn ch  phân gii th nhy
thp và khó phát hic mt hn hp ch [63].
Halpaap (1973) u tiên nhn thy rng tin ích ca các ht silica gel
c nh (5-6 µm) v thi gian khai trin, giá tr h s  R
f
và chiu
cao bn mng khi chun b các bu
tiên công b chính thc v HPTLC. Cùng vi s h tr ca h thng máy móc,
  lp li c
c s dng rt
hình thc tân tin nht ca công c TLC [21], [36].
c ký lp mng (TLC) mà c th c la
chn  phân tích du vân tay sc ký vì tính linh hot, nhanh và kinh t. HPTLC có
th nhn dic nhiu mu khác nhau ti cùng thm và có th tách t dch
chit thô cc liu vi h dung môi thích hp mà không cn quá trình tinh ch
  c s d  xác
nh vân tay sc ký cc liu.
15

1.2.3. ng dc ký lp mng hi
(HPTLC)
     u chun hóa thành phn tác d  c

OH
HO
H
HOR
1

R
2

Acid gymnemic I
tigloyl
Ac
Acid gymnemic II
2-methyl butyroyl
Ac
Acid gymnemic III
2-methyl butyroyl
H
Acid gymnemic IV
tigloyl
H Công thc phân t: C
30
H
50

my gia n và din tích pic. Kt qu ng
   ng Gymnemagenin trong lá dây thìa canh Gymnema sylvestre
(Retz) R. Br. ex Schult chim 1,61% trng khô ca lá [42].
 6, Valivarthi S. R. và cng s cho r   a V.
Puratchimani và S. Jha cc ci thin thông qua vic thy phân bng acid và
base dch chit methanol ca Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. Kt qu
ca Valivarthi S. R. và cng s cho thy khi dch chic thy phân, pic sc ký
ca Gymnemagenin trong mu th nha khi kim tra li
bc ci thin này cho thy du
vt ca Gn thy Gymnemagenin trong
dch chic chun b c tin hành ca V. Puratchimani
[43]. 17

 HIÊN CU
2.1. NGUYÊN VT LIU NGHIÊN CU
2.1.1. Mu nghiên cu
Các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) c thu
hái ti 5 tnh: Tây Ninh, Gia Lai, Hòa Bình, Thái Nguyên, Tuyên Quang c
nh tên khoa h    mu ti b môn Thc vt  Ti hc
c Hà Ni (Mã hiu tiêu bn HNIP/18068, 18090  18093/14).
Bng 2.1. V u trong nghiên cu.
STT
Mã
mu


X
X
X
3.
GL3
Thung Nai, Cao Phong, Hòa Bình
(20
o

o

X
X
X
4.
GL4

(21
o

o
)
X
X
X
5.
GL5
Yên Nguyên, Chiêm Hóa, Tuyên Quang
(22