Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***
NGUYỄN THỊ THU HUYỀN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,
PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN
FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM
CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC
Mã số: 60420103
LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hà Nội, 2014


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

Lời cảm ơn
Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đối tới
ban lãnh đạo Viện sốt rét – ký sinh trùng và côn trùng ương, Khoa sinh học
phân tử thuộc viện Sốt rét, phòng Ký sinh trùng, phòng Sau đại học cùng với
ban lãnh đạo viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc Doanh,
người thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong
quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này!
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em thuộc khoa Sinh học phân tử
- Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương và phòng Ký sinh trùng
viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy/cô trong Hội đồng chấm luận văn
đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của tôi được hoàn thiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn, người thân, bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ
tôi và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến 2 bên Cha, Mẹ
đã vất vả sinh thành, nuôi dưỡng cũng như tạo điều kiện để tôi có được kết
quả như ngày hôm nay. Cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chồng và
con tôi! Những người luôn sát cánh bên tôi và luôn là chỗ dựa tinh thần để
tôi có thể hoàn thành tốt nhất luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 Năm 2014 Nguyễn Thị Thu Huyền


1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới 6
1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn 6
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người 7
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 9
1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam. 11
1.3.1. Mầm bệnh 11
1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò. 12
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam 12
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 13
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG,ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNGVÀPHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam. 15
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 15
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 15
2.3. Nội dung nghiên cứu 15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

2.4. Phương pháp nghiên cứu 15
2.4.1. Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò: 15
2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò 16
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn 16
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử 16
2.4.5. Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớn 17
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium: 17
2.4.7. Phương pháp gây nhiễm miracidium cho ốc 17
2.4.8. Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria 18
2.4.9. Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPPS. 18
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

0
C 32
Hình 3.7. Miracidium của sán lá gan F. gigantica 32
Hình 3.8. Ba loài ốc Lymnaea ở Việt Nam 39
Hình 3.9. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng sán lá gan 44
Hình 3.10. Metacercaria sống (a) và chết ở nước muối 1,5% sau 15 phút (b) 48
Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ muối 3 và 5% lên rau dấp cá, rau diếp
và rau ngổ sau thời gian ngâm 15 phút 49
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nước muối 2% đến các loại rau sau khi ngâm 15
phút 50
Hình 3.13. Một muỗng canh muối 20 gram pha trong 1 lít nước để rửa rau
sống 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nước và vùng địa lý 10
Bảng 3.1. Kích thước sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiện cứu 20
Bảng 3.2. So sánh kích thước của các nhóm sán lá gan có hình dạngcơ thể
khác nhau 21
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu 22
Bảng 3.4. So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài sán lá gan 23

NAD1 : Nicotinamide dehydrogenase subunit 1
PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase)
SR : Sốt rét
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) 1

MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của đề tài
Bệnh sán lá gan lớn gây nên bởi các loài sán lá Fasciola spp., phổ biến
là 2 loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758và Fasciola giganticaCobbold,
1855, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và gây thiệt hại cho
ngành chăn nuôi.Hơn thế nữa, sán lá gan còn gây bệnh cho người.Theo tổ
chức Y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn là một trong những vấn đề y tế
quan trọng và luôn được quan tâm nghiên cứu. Người và động vật nhiễm
bệnh sán lá gan lớn do ăn phải rau, cỏ hoặc uống nước lã có chứa ấu trùng
cảm nhiễm metacercaria. Sán trưởng thành ký sinh ở gan vật chủ, gây tổn
thương chủ yếu ở gan, nhưng cũng có thể gây tổn thương ngoài gan khi ký
sinh lạc chỗ (Dalton 1999).
Trong vòng đời phát triển của sán lá gan lớn, trứng được thải ở gan vật
chủ, theo ống dẫn mật xuống ruột và ra môi trường cùng với phân. Gặp điều
kiện thuận lợi, trứng phát triển và nở ra thành ấu trùng
miracidium.Miracidium bơi trong nước, tìm vật chủ trung gian thích hợp để
xâm nhập và phát triển thành các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và
cercaria.Cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc, rụng đuôi hoá nang bám vào
thực vật thuỷ sinh hoặc trôi nổi trong nước. Khi vật chủ chính ăn phải thực

Fasciola spp. ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài: Làm sáng tỏ đặc điểm phân loại và sinh học của sán
lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Cung cấp dẫn liệu chính xác về phân loại và đặc điểm sinh học của sán lá
gan lớn ở Việt Nam.
- Tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng chống sán lá gan lớn một cách hiệu
quả, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
4. Những điểm mới của luận văn

3

- Xác định chính xác sán lá gan lớn ở Việt Nam là loài F. gigantica và có
các cá thể lai hoặc chuyển gen giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica.
- Xác định khả năng sống của trứng sán lá gan trong các dung dịch nồng độ
muối khác nhau, điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Xác định thời điểm nở trong ngày, đặc điểm bơi, độ sâu ưa thích và thời
gian sống của miracidium.
- Khẳng định chỉ có loài ốc A. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn F.
gigantica(= L. viridis) ở Việt Nam, còn loài R. auricularia (= L. swinhoei)
không bị nhiễm.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sức sống của metacercaria, đưa
ra nồng độ muối thích hợp nhất để rửa sau sống an toàn là 2% ngâm trong 15
phút.

và hình dạng cơ thể.Loài F. hepatica ngắn hơn và rộng hơn, trong khi loài F.

5

gigantica dài hơn và hẹp hơn.Ngoài ra loài F. hepatica có phần đầu rộng hơn,
làm thành bờ vai, còn loài F. gigantica thuôn hơn (Dalton et al. 1999; hình
1.1).Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loài này về mặt
hình thái.
1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn
Trong vòng đời phát triển, sán lá gan lớn trải qua 5 giai đoạn (hình 1.2),
bao gồm:
Giai đoạn trứng được thải khỏi vật chủ ra môi trường ngoài: Trứng sán lá
gan lớn được bài tiết theo phân vật chủ ra ngoài môi trường. Trong môi
trường nước, trứng phát triển thành ấu trùng miracidium.
Giai đoạn miracidium tìm kiếm và xâm nhập vào vật chủ trung gian: Trong
môi trường nước, miracidium tìm kiếm vật chủ ốc thích hợp để xâm nhập vào
vật chủ, chủ yếu là ốc Lymnaea.
Giai đoạn phát triển và tăng sinh số lượng trong cơ thể ốc: Trong cơ thể ốc,
ấu trùng sán phát triển qua các giai đoạn sporocyt, redia mẹ, redia con, và
cuối cùng là cercaria.
Giai đoạn cercaria thoát khỏi ốc và hoá nang: Sau khi rời khỏi ốc, cercaria
bơi trong nước và hóa nang thành metacercaria bám vào bề mặt thực vật thuỷ
sinh. Một số metacercaria không bám được vào thực vật thuỷ sinh mà trôi nổi
tự do trong nước.
Giai đoạn metacercaria được vật chủ cuối cùng ăn và phát triển thành sán
trưởng thành.
Con người và động vật khi ăn thức ăn (rau thuỷ sinh đối với con người và cỏ
đối với động vật) chứa ấu trùng giai đoạn lây nhiễm hoặc uống phải nước có
chứa mầm bệnh thì ấu trùng thoát khỏi vỏ nang trong đường ruột, xuyên qua
niêm mạc ruột vào khoang khúc mạc và sau đó di chuyển tới gan, đường mật.

rằng F. gigantica có ở cả phía Nam nước Mỹ và Hawaii, nhưng không có
bằng chứng để chứng minh loài này trên nước Mỹ. Một số vùng có sự phân
bố của cả 2 loài (Dalton 1999).Ở những vùng có sự chồng chéo của 2 loài
xuất hiện dạng trung gian khó có thể kết luận là loài nào.Ở châu Á và châu
Phi, có nhiều dạng trung gian đã được phát hiện, một số giống F. hepatica, số
khác giống F. gigantica, và một số dạng trung gian.Sự lai và chuyển gen giữa
2 loài sán lá gan, F. hepatica và F. gigantica đã được thông báo ở các nước
châu Á, như Hàn Quốc (Agatsuma et al. 2000; Choe et al. 2011), Nhật Bản
(Itagaki et al. 2005), Iran (Ashrafi et al. 2006; Amor et al. 2011), Trung
Quốc (Peng et al. 2009; Ai et al. 2011) và Việt Nam (Le et al. 2008) cũng như
các nước châu Phi (Periago et al. 2008; Amer et al. 2011).
Một nghiên cứu hình thái tỷ mỉ và chính xác đã thực hiện để xem liệu có phân
biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica không.Tác giả kết luận rằng các chỉ số
chiều dài/rộng cơ thể (BL/BW) và khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút
cuối cơ thể có ý nghĩa phân biệt 2 loài (Periago et al. 2006).
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người
Trâu, bò, cừu là động vật nuôi bị nhiễm sán lá gan lớn nặng nhất.Mặc
dù, dê, ngựa, lợn, hươu và nhiều loài động vật khác cũng có thể bị nhiễm,
nhưng ít quan trọng hơn ở những động vật này.Nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ
nhiễm hai loàiđược thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Tỷ lệ nhiễm dao

8

động lớn từ 1-81,4%, tuỳ thuộc vào loài gia súc và địa điểm nghiên cứu
(Dalton 1999).
Bệnh sán lá gan lớn ở người là một vấn đề sức khoẻ quan trọng ở nhiều quốc
gia trên thế giới (Dalton 1999).Bệnh sán lá gan lớn ở người thông báo từ châu
Âu, châu Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Đại Dương. Một phân tích toàn cầu
cho thấy mặc dù số ca bệnh sán lá gan lớn ở người không hiếm ở những nơi
có động vặt ăn cỏ bị nhiễm bệnh, tỷ lệ nhiễm cao/thấp ở người không liên

vùng dịch tễ cao sán lá gan lớn thích nghi tốt hơn với vật chủ người. Thời
gian nhiễm ở người chưa biết rõ, nhưng ước tính rằng chúng có thể sống tới
13,5 năm (Dalton 1999).
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn
Sán lá gan không có mặt ở những vùng mà điều kiện không thuận lợi cho sự
phát triển của ốc - vật chủ trung gian, thường là ốc thuộc họ Lymnaeidae.Ốc
Lymnaeidae rất đa dạng về hình thái và thành phần loài, vì thế hệ thống phân
loại của chúng rất phức tạp, vị trí phân loại của nhiều loài và giống có sự thay
đổi.Ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan khác nhau
tùy thuộc vào loài sán và vùng địa lý.
Vật chủ trung gian của F. hepatica
Ốc điển hình liên quan đến truyền bệnh do F. hepatica là Lymnaea
truncatula. Ốc L. truncatula có khả năng thích nghi với nhiều môi trường
sống như độ cao (>4000m) ở Bolivian Altiplano.Ngoài ra, còn các loài ốc
khác.Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian của
F. hepatica ở các nước và vùng địa lý (Boray 1985).

10

Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nƣớc và vùng địa lý
Loài ốc
Nƣớc
L. bulimoides
Australia, USA

L. proxima proxima
Mỹ
L. modicella
Mỹ
Stagnicola montanensis
Mỹ
F. (Galba) bulimoides
Nam Mỹ
G. bulimoides techella
Nam Mỹ

Vật chủ trung gian của F. gigantica
Ốc điển hình liên quan đến truyền sán lá gan F. gigantica là loài
Lymnaea auricularia.Kendall (1954, 1965) kết luận rằng không dễ dàng phân
biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái của các dòng ốc thuộc loài L.

11

auricularia.Tác giả cho rằng các dòng ốc vật chủ trung gian của sán lá gan ở
nam, tây và đông châu Phi là L. a. natalensis; ở Ấn Độ, Bangladesh và
Pakistan là L. a. rufescens; ốc vật chủ ở Đông Nam Á là L. a. rubiginosa. Một
loài ốc tương tự, L. ollula, là vật chủ của F. gigantica ở Nhật Bản (Uneno and
Yoshihara 1974) và Hawaii (Alicata 1938).
Vai trò chính của L. auricularia là vật chủ trung gian của F. gigantica
(Kendall 1954).Tuy nhiên, một số loài ốc khác cũng bị nhiễm F.
gigantica.Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian
của F. gigantica ở các nước và vùng địa lý (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Vật chủ trung gian của F. gigantica ở các nƣớc và vùng địa lý
Loài ốc
Nước

Phan Địch Lân (1985) tổng kết tình hình nhiễm sán lá gan ở trâu bò cho thấy
tỷ lệ nhiễm tăng theo lứa tuổi và tăng dần từ miền biển đến miền núi, trung du
và đồng bằng; tỷ lệ nhiễm giao động từ 13,7 - 61,3%. Hồ Thị Nhuận và
Nguyễn Ngọc Phương (1987) điều tra ở các tỉnh miền Nam cho thấy tỷ lệ trâu
bò nhiễm sán lá gan từ 1,4-36,2%. Vũ Sĩ Nhàn và cs. (1989) công bố tỷ lệ
trâu bò nhiễm sán lá gan ở ở đồng bằng (44,5%) cao hơn so với ở miền biển
(4,1%).Nguyễn Trọng Kim và Phạm Ngọc Vĩnh (1997) công bố tỷ lệ nhiễm
sán lá gan lớn ở trâu bò tại Hà Bắc (cũ) là 49,95%; ở Nghệ An từ 25,27 –
32,65%; tỷ lệ nhiễm chung ở miền Bắc là 43,56%. Kết quả nghiên cứu của Lê
Hữu Khương và cs. (2001) cho thấy tỷ lệ nhiễm trung bình trên cả nước ở trâu
là 46,23%, dao động từ 8,74 – 61,09%, ở bò là 30,64%, tỷ lệ nhiễm tăng dần
từ miền Nam ra miền Bắc.
Những năm gần đây, Đỗ Đức Ngái và cs. (2006) thông báo tỷ lệ nhiễm sán lá
gan ở Đăk Lăk từ 34,2-62,6%. Nguyễn Khắc Lực và cs. (2010) nghiên cứu tại
Quảng Nam, đã xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên 245 trâu bò cho thấy
tỷ lệ nhiễm chung là 40,8%. Có thể nói, tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu
bò tại một số địa điểm ở nước ta vẫn còn cao.
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam
Những ca bệnh sán lá gan lớn ở người ở Việt Nam đã được chẩn đoán từ lâu.
Gần đây, số bệnh nhân sán lá gan ngày càng tăng, đặc biệt là ở miền Trung và
Nam (Lê Quang Hưng và cs. 2003; Trần Vinh Hiển và cs. 2006). Riêng tại
phòng khám Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn đã khám và
điều trị cho khoảng 2.600 bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn. Số ca bệnh cao
nhất tại các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt các tỉnh Quảng Nam,
Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Gia Lai (Nguyễn Văn Chương và cs.
2009). Điều tra cắt ngang tại cộng đồng ở Quảng Nam, Quảng Bình, Bình

13

Định, Phú Yên và Gia Lai cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn từ 0,2-2,1%

Thị Lê 2005;Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et al. 2013).Vì vậy, còn có
những thông báo khác nhau về vai trò vật chủ trung gian truyền bệnh sán lá
gan của 2 loài ốc này.
Phan Địch Lân (1985) thông báo cả 2 loài ốc L. viridis và L. swinhoei
đóng vai trò là vật chủ trung gian của sán lá gan.Nguyễn Trọng Kim và Phạm
Ngọc Vĩnh (1997) cũng thông báo cả 2 loài ốc Lymnaea đều bị nhiễm ấu trùng
sán lá gan với tỷ lệ nhiễm rất cao 43,1-62,1% ở tỉnh Hà Bắc (cũ).Cũng theo
Nguyễn Trọng Kim (1997) công bố tỷ lệ nhiễm trung bình ở các tỉnh miền Bắc
ở ốc L. swinhoei là 20,8% và ở ốc L. viridis là 19,6%.Vũ Sĩ Nhàn và cs. (1989)
cũng cho thấy ốc L. swinhoei ở Đak lak nhiễm ấu trùng sán lá gan với tỷ lệ là
40,0-50,0 %.Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương (1987) cũng công bố cả 2
loài ốc ở các tỉnh miền Nam đều là vật chủ trung gian của sán lá gan, nhưng tỷ
lệ nhiễm nhiễm rất thấp (1,1%). Trong khi đó, Nguyễn Thị Lê và cs. (1995)
không tìm thấy ấu trùng sán lá gan từ hơn 1.000 ốc Lymnaea ở tỉnh Hà Tây
(cũ). Gần đây, Dang and Nawa (2005) công bố 1,2-2,1% ốc Lymnaea ở tỉnh
Bình Định bị nhiễm ấu trùng sán lá gan; Đỗ Đức Ngái và cs. (2006) thông báo
tỷ lệ nhiễm ở ốc L. swinhoei ở Đak Lak là 0,45%. Kết quả điều tra của Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005) cho thấy chỉ 0,06% và 1% ốc L. viridis
ở Đông Anh và Phú Xuyên, Hà Nội bị nhiễm ấu trùng sán lá gan. Phạm Ngọc
Doanh và cs. (2012) điều tra trên toàn quốc chỉ phát hiện ấu trùng sán lá gan ở
ốc L. viridis với tỷ lệ thấp từ 0,6-4,0%. Dung et al. (2013) cũng chỉ phát hiện
ốc L. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan.
Như vậy, có thể nói vấn đề định loại sán lá gan lớn Fasciolaspp. và ốc
vật chủ trung gian của chúng ở Việt Nam chưa được thống nhất giữa các
nghiên cứu.Xác định chính xác những vấn đề này rất quan trọng đối với khoa
học và thực tiễn, giúp cho công tác phân loại, tiến hóa và phòng chống bệnh
sán lá gan ở người và động vật, và cần được làm sang tỏ. 15

16

giữa 2 lam kính (nhưng không dùng lực ép) trong dung dịch Bouine trong 30
phút, sau đó bảo quản trong cồn 70%.
- Các mẫu dùng để nghiên cứu phân tử được bảo quản trong cồn tuyệt đố.
2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò
- Lấy chất dịch từ túi mật bò bị nhiễm sán lá gan lớn lọc bằng nước cất đến
khi sạch để theo dõi sự phát triển của trứng.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn
- Chọn 55 mẫu sán trưởng thành (có trứng ở tử cung) ở mỗi địa điểm nghiên
cứu, gồm các mẫu sán có hình thái và kích thước khác nhau, làm tiêu bản cố
định bằng cách nhuộm carmine alumine.(Periago et al 2006)
- Sán được đo kích thước chiều dài và chiều rộng cơ thể, từ đó tính tỷ lệ chiều
dài/rộng (BL/BW) và đo khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút cuối cơ thể.
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử
- Chọn đoạn ITS1-5.8S-ITS2 của gen nhân để phân tích.
- Mẫu nghiên cứu gồm: các mẫu sán lá trưởng thành có hình thái khác nhau
tại 3 địa điểm nghiên cứu.
- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu bằng DNeasy kit (QIAgen).
- Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi BD1: 5’-
GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3’và BD2: 5’-TATGCTTAAATT
CAGCGGGT-3’ (Oskouei et al. 2001).Kiểm tra sản phẩm PCR bằng gel
Agarose 2%. Tinh chế sản phẩm PCR bằng bộ hóa chất QIAquick PCR
purification kit.
- Phản ứng giải trình tự được tiến hành với bộ kit Big-Dye terminator cycle
sequencing kit v3.1 (ABI). Trình tự được đọc trực tiếp bằng máy tự động ABI
3100. Đối chiếu các trình tự thu được với các trình tự trong ngân hàng gen
bằng chương trình BLAST. Sử dụng chương trình phần mềm MEGA6
(Tamura et al. 2013) để xử lý, phân tích số liệu, xây dựng cây phát sinh chủng
loại và đánh giá mối quan hệ tiến hóa.