BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI
DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA
LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU
HÁI Ở HOÀ BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI
DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA
LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU
HÁI Ở HOÀ BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng
DS. Đoàn Thị Ái Nghĩa


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 2
1.1.1. Về thực vật 2
1.1.2. Về đa dạng di truyền 4
1.1.3. Về thành phần hoá học 5
1.1.4. Về tác dụng sinh học 6
1.1.5. Về độc tính 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8
1.2.1. Về phân lập một số hợp chất 8
1.2.2. Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn 9
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….12
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 12
2.1.1. Nguyên vật liệu 12
2.1.2. Động vật thí nghiệm 12
2.1.3. Dung môi, hoá chất 12
2.1.4. Máy móc - thiết bị 13
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13
2.2.1. Nghiên cứu phân lập một số chất tinh khiết 13
2.2.2. Xác định độc tính bán trường diễn 13
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu phân lập một số hợp chất 13
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu về độc tính bán trường diễn 15
2
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18
3.4. PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT 18

AST Aspartat aminotrasferase
CDCl3 Cloroform
d Double – đỉnh đôi
DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
ĐTĐ Đái tháo đường
EA Ethyl acetat
ITS Internal Transcribed Spacer
s Singlet – đỉnh đơn
SKC Sắc kí cột
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TMS Tetramethyl silan
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE9 và chất
tham khảo
21

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE7 và chất
tham khảo
23

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến
khối lượng cơ thể của chuột cống trắng
25

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến
các chỉ số huyết học của chuột cống trắng
25

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến
các chỉ số sinh hóa của chuột cống trắng

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ Dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex
Wight)
18

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập phân đoạn E1 từ Dây thìa canh
lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)
19

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất GLHE9 22

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất GLHE7 24

Hình 3.5 Hình ảnh vi thể gan, thận lô thử và lô chứng
của chuột thí nghiệm
28

Hình 3.6 Các định hướng nghiên cứu tác dụng của
lupeol
31
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) đã được nền
y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda sử dụng từ hơn 2.000 năm để điều trị đái
tháo đường [29], [32]. Dựa trên kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu liên quan
đến Dây thìa canh đã được thực hiện và một số sản phẩm từ dược liệu này đã
được phát triển sử dụng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường.

+ Bộ Long Đởm (Gentianales)
+ Họ Trúc Đào (Apocynaceae)
+ Phân Họ Thiên lý (Asclepiadoideae)
+ Chi Gymnema R.Br.
+ Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Ở Ấn Độ, Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) còn
được biết đến với các tên đồng nghĩa khác là Gymnema khandalense và
Gymnema kollimalayanum [20].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của loài
Thân leo tới 6 m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá
1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa
trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng
đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi
thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông
măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp
gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ
lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [12].
3

(b) Dạng sống; (c) Cụm hoa; (d) Mặt trên lá; (e) Mặt dưới lá; (f) Cụm
hoa xim; (g) Lá bắc của cụm hoa; (h) Một hoa nguyên vẹn; (i) Đài; (j) Tràng;
(k) Trụ nhị nhụy; (l) Thể truyền phấn; (m) Bộ nhụy; (n) Quả
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall. ex Wight [12]
4
Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với
đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi.
Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc.
Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm×5 mm, mép dạng màng; mào lông
dài 3 cm [12].
Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng

Sản phẩm thuỷ phân phân đoạn ethyl acetat của Dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có pic sắc ký tương ứng với
gymnemagenin trên sắc ký đồ (Hình 1.3) [12].
Cho đến nay, chưa xác định được tài liệu nào trên thế giới và ở Việt Nam
công bố về các hợp chất được phân lập từ Dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight). 6Hình 1.3: Định tính gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat trong
mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight [12]
1.1.4. Về tác dụng sinh học
Theo Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự [7], dịch chiết lá
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) ở Việt Nam có tác
dụng hạ đường huyết trên cả chuột bình thường (24,07 %) tác dụng cao nhất
thể hiện sau 4 giờ, kéo dài đến 5 giờ và trên chuột gây tăng đường huyết bởi
Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết. Liều dùng thích
hợp lá dây thìa canh là cắn toàn phần được pha thành hỗn dịch trong nước cất
với tỉ lệ 1:1, với liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g lá khô/kg thể trọng.
Kết quả thử nghiệm cho thấy tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) mạnh hơn Dây thìa
canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br. ex Schult.). Kết quả này đã được
chuyển giao cho Công ty Dược Khoa (DK-Pharma) của Trường Đại học
Dược Hà Nội, là nơi duy nhất ở Việt Nam trồng trọt Dây thìa canh lá to theo
quy trình hướng dẫn “Thực hành tốt Trồng trọt cây thuốc” (GAP- WHO).
Công ty đã cho ra đời sản phẩm Trà tiểu đường DK-Betics, phần cốt lõi là
cây thuốc Dây thìa canh và Dây thìa canh lá to.



8
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.2.1. Về phân lập một số hợp chất
1.2.1.1. Chiết xuất
* Phương pháp ngâm lạnh
Sau khi chuẩn bị dược liệu, dung môi được đổ cho ngập dược liệu trong
bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng
loại dược liệu), tại nhiệt dộ phòng, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa
dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết
xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới
rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi) [5].
* Phương pháp ngấm kiệt đơn giản
Sau khi chuẩn bị dược liệu và dung môi trong bình ngấm kiệt. Sau một
khoảng thời gian xác định (tuỳ từng loại dược liệu), rút nhỏ giọt dịch chiết ở
phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung
môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp dược liệu nằm yên (không được khuấy
trộn). Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt dược liệu
khoảng 3-4 cm [5].
1.2.1.2. Phân lập và xác định cấu trúc hoá học
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế cột
hấp phụ và cột lọc qua gel. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn dung
môi, theo dõi quá trình rửa giải.
* Sắc ký cột hấp phụ:
Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong
hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua,
pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy
mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ
phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [2], [17].
9

1.2.2. Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu về độc tính của thuốc đóng vai trò vô cùng quan trọng để
đảm bảo tính an toàn của thuốc, thuốc dù tác dụng mạnh đến mấy mà không
an toàn thì cũng sẽ không được sử dụng [1].
10
Độc tính bán trường diễn là một trong các nội dung về nghiên cứu độc
tính gồm có: độc tính cấp; độc tính trường diễn (độc tính bán cấp, độc tính
độc tính bán trường diễn, độc tính trường diễn); độc tính tại chỗ và độc tính
chuyên biệt (độc tính sinh biến chủng, độc tính ung thư, độc tính trên sinh sản
và phát triển) [1].
Một số qui định về thử nghiệm độc tính bán trường diễn [1], [9]:
- Thời gian: phụ thuộc vào thời gian dùng thuốc cho người, thường gấp
4 lần thời gian dùng thuốc cho người.
- Động vật thí nghiệm: thỏ, chuột cống trắng; giống đực hay cái tùy thí
nghiệm; số lượng mỗi lô, thường với thỏ là 6 và với chuột là 10.
- Đường dùng thuốc: đường dùng dự kiến dùng cho người, ngoài ra có
thể thêm một đường dùng khác.
- Liều dùng: thường tính từ liều thể hiện tác dụng trên động vật thí
nghiệm hoặc có thể lấy liều dùng của người làm cơ sở, rồi dùng phép
ngoại suy tính ra liều của động vật thí nghiệm.
- Các thời điểm theo dõi: trước khi bắt đầu thí nghiệm; trong khi dùng
thuốc, ngay sau khi dùng thuốc; sau khi ngừng thuốc một thời gian để
theo dõi sự hồi phục; xét nghiệm đại thể và vi thể các cơ quan thì tiến
hành lúc: ngay khi con vật chết, con vật còn hấp hối nhưng triển vọng
sẽ chết, sau khi kết thúc thí nghiệm.
- Các thông số quan sát sẽ tuỳ thuộc đề tài. Một số các chỉ tiêu :
o Biểu hiện chung: hành vi, lông, cân nặng, mức ăn uống…
o Các thông số huyết học: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tỷ lệ
huyết sắc tố, thời gian máu đông, máu chảy…
o Các thông số thuộc chức năng gan: ALT và AST, bilirubin,

Chuột cống trắng chủng Wistar, cả 2 giống, khỏe mạnh, cân nặng từ
200-220g, do Học viện Quân y cung cấp. Động vật được nuôi ổn định trong
điều kiện phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu.
Thức ăn: Thức ăn viên tổng hợp do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung
cấp chứa tỷ lệ thích hợp protein, carbonhydrat, mỡ, chất khoáng, vitamin, chất
xơ.
Nước uống: Nước máy sinh hoạt.
2.1.3. Dung môi, hoá chất.
Dung môi: methanol, ethanol 70, n-butanol, n-hexan, ethyl acetat,
chloroform, aceton, nước cất Thuốc thử: dung dịch H
2
SO
4
10%/Ethanol
tuyệt đối
Chất nhồi cột sắc kí: silicagel pha thường (silicagel 60; 0,040 – 0,063
mm (230 – 400 mesh ASTM); Merck), pha đảo (YMC, 30 - 50m, Fuji
Silysia Chemical Ltd.), Sephadex LH 20.
Bản sắc kí lớp mỏng pha thường (TLC - silicagel 60 F
254
, 250 µm,
Merck), pha đảo RP
18
(Merck, RP C - 18 F
254
)
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của
Dược Điển Việt Nam IV.

13

* Chiết xuất các phân đoạn
Nguyên lý: Chiết xuất các chất được phân tán trong các dung môi khác
nhau dựa trên độ phân cực và độ tan khác nhau của các chất trong các dung
môi đó [17].
Tiến hành: Phân tán cắn toàn phần trong nước, rồi tiến hành chiết phân
đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan,
ethyl acetat, n-butanol. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm lần lượt thu
được các cắn n- hexan, ethyl acetat, n-butanol. Dịch nước còn lại đem cô cách
thuỷ thu được cắn nước.
* Chiết pha rắn
Nguyên lý: Chiết pha rắn được tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có
kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu đem chiết (thường áp dụng với
lượng cao chiết lớn trên 10g). Pha tĩnh hay sử dụng là silicagel pha thường
(silicagel 60, 0,040 - 0,063 mm (230-400 mesh ASTM), Merck). Dịch chiết
cao dược liệu được tẩm với lượng vừa đủ silicagel rồi thực hiện cất loại dung
môi thu được bột khô tơi. Lượng bột khô này được đưa lên cột sắc ký, sau đó
rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
Tiến hành
- Cắn phân đoạn được hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó tẩm
với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel ẩm này
được quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn. Bột khô thu được
dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
- Chuẩn bị cột: cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự
nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá. Cho silicagel
pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 30 cm, hoạt hoá
15
cột, sau đó đưa lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để
bột phân bố đều.
- Triển khai cột với hệ dung môi rửa giải lần lượt là n-hexan 100%, n-
hexan: ethylacetat với các tỷ lệ 40:1, 20:1, 10:1 và ethylacetat 100%

Nguyên liệu: lá dược liệu được xay tới bột thô, sấy ở 45
0
C tới hàm ẩm
< 5%. Dược liệu được thấm ẩm bằng dung môi ethanol 40
0
và đậy kín trong 2
giờ.
16
Chiết xuất dược liệu: lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát
dịch chiết để bột dược liệu không gây tắc ống và lẫn vào dịch chiết. Sau đó
đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn vào đáy bình. Cho từ từ bột dược liệu đã được
thấm ẩm vào bình, vừa cho vừa san đều và nén nhẹ. Đổ dung môi vào bình
chiết cho tới khi có vài giọt chảy ra thì đóng khóa lại. Tiếp tục đổ dung môi
đến khi cách mặt dược liệu 3-4cm, ngâm lạnh trong 48 giờ. Hết thời gian
ngâm lạnh, mở khóa cho dịch chiết chảy ra với tốc độ là 20 giọt/phút. Chú ý
cho thêm dung môi đảm bảo ngập mặt dược liệu từ 2-3cm.
- Dịch chiết thu được đem cô đến cắn, phân tán trong nước tạo hỗn dịch
1:2.
2.3.2.2. Thử độc tính bán trường diễn.
Bố trí thí nghiệm: Chuột cống trắng cả 2 giống được chia ngẫu nhiên
thành 3 lô, cho uống thuốc thử hoặc nước vào một giờ nhất định liên tục trong
28 ngày, căn cứ vào liều tác dụng trên người 10g dược liệu khô/kg thể trọng:
- Lô chứng (n=10): uống nước với thể tích 1ml/100g chuột.
- Lô thử liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa canh lá to
với liều 1,4 g/kg chuột (tính theo dươc liệu khô).
- Lô thử liều 2: gấp 3 liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa
canh lá to với liều 4,2 g/kg chuột (tính theo dược liệu khô).

Hình 2.1. Quy trình thử độc tính bán trường diễn của dịch chiết
17