TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ TẤN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP
• CHÁT
•

•

FLAVONOIT TỪ CÂY BÀN CHUA
(SONNERRATIA CASEOLARIS)

KHÓA LUẬN
• TỐT NGHIỆP
• ĐẠI
• HỌC
•
Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Hoài Nam

HÀ NỘI - 2015


Trường Đ ại Học Su’ Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp


1.1.2. Sinh học, sinh t h á i ................................................................................................ 3
1.1.3. Công d ụ n g .............................................................................................................. 3
1.1.4. Thành phần hóa h ọ c ............................................................................................. 4
1.2. Giới thiệu về lớp chat flavonoid [6 , 7].................................................................7
1.2.1. Giới thiệu c h u n g ....................................................................................................7
1.2.2 Các nhóm fla v o n o id ............................................................................................. 8
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực v ậ t ................................................................ 12
1.3.1. Chọn dung môi c h i ế t ..........................................................................................12
1.3.2. Quá trình c h iết..................................................................................................... 14
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu c ơ ......................16
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc k í ......................................................16
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc k í .........................................................................16
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc k í ................................................................... 17
1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu c ơ .....21
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, I R ) ...............................................21
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, M S )................................................... 22
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy N M R )...................................................................................................... 23
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .................26
2.1. Mầu thực v ậ t ...........................................................................................................26
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất.................................................................. 26
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (T L C ).....................................................................................26

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2



Khóa Luận Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 4.1; D ữ liệu phô của B C W 7 ............................................................................. 36
Bảng 4.2: D ữ liệu phô của B C W 5 ..............................................................................41
Bảng 4.3: dữ liệu phổ NMR của hợp chất B C W 6 ....................................................46
Hình 1.1 : Flavan (2 - Phenyl chrom an).....................................................................7
Hình 1.2: Flavon và flavonol...................................................................................... 8
Hình 1.3: Flavanonol - 3

.......................................................................................... 9

Hình 1.4: C h a c o l............................................................................................................9
Hình 1.5: A u r o n ........................................................................................................... 10
Hình 1.6: Antoxianidin............................................................................................... 10
Hình 2.1: Bần chua - Sonneratia caseolaris (L.) Engl......................................26
Hình 3.1.a: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Bần chua Sonneratia caseolaris 29
Hình 3.1 .b: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước mẫu
cây Bần c h u a ..................................................................................................................30
Hình 4 .l.a: Phổ ' h - NMR của B C W 7 ..................................................................... 33
Hình 4.1.b: Cấu trúc của hợp chất B C W 7................................................................ 34
Hình 4.1.c: Phổ l3C - NMR của B C W 7 ....................................................................34
Hình 4.1 .d: Phổ HSQC của B C W 7 ............................................................................ 35
Hình 4.1.e: Phổ HMBC của B C W 7 ........................................................................... 37
Hình 4.1.f: Một số tương tác HMBC của B C W 7 ................................................... 38
Hình 4.2.a: c ấ u trúc của hợp chất B C W 5 ................................................................ 38
Hình 4.2.b: Phổ l3C - NMR của B C W 5 ....................................................................38
Hình 4.2.c: Phổ ' h - NMR của B C W 5 ..................................................................... 39

13c - NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

' h - NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

' H-'H

' h - ' h Chemical Shift Correlation Spectroscopy

COSY
2D - NMR

Phố cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two - Dimensional
NMR

cc

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

El - MS


Phổ hong ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sac ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Sinh viên: Nguyen Thị Tan

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

M Ở ĐẦU

Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng


1

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Khoá luận này tập trung nghiên cứu thành phần ílavonoit của lá cây
Bần chua tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm
thuốc mới, các giải pháp điều trị bệnh.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Phân lập hợp các hợp chất flavonoit từ lá cây Bần chua bằng các
phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất đã phân lập được bằng
các phương pháp phổ.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

2

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp



3

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

đắp chữa các vết thương dụng dập. Ở Malaixia, lá giã lẫn với cơm dùng làm
thuốc đắp chữa bí tiểu tiện. Quả già làm thuốc diệt giun, còn nước ép từ quả
xanh làm thuốc giảm ho. [ 1 ],[ 2 ]
1.1.4. Thành phần hóa học
Năm 2006, Samir Kumar Sadhu và cộng sự (Bangladesh và Nhật Bản)
công bố 2 hợp chat flavonoid từ phần lá loài Sonneratia caseolarỉs thu thập
tại Bangladesh, cả 2 hợp chất này đều thế hiện hoạt tính chống oxi hóa [3].

Luteolin

Luteolin 7 - rutinoside

Năm 2009 nhóm nghiên cứu của Shi Biao Wu (Trung Quốc) tách được
9 hợp chất từ quả cây Bần chua, trong đó 2 hợp chat nor - lignans (1, 2) và 2
dẫn xuất 6 H - benzo[b,d]pyran - 6 - one (3, 4) được phần lập lần đầu tiên từ
chi Sonneratia có thế coi là các các chất “chỉ dấu” (taxonomic markers) cho
việc phân loại chi này. Ket quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế
bào u thần kinh đệm chuột c - 6 cho thấy các chất 1 , 2 , và 6 thể hiện khả năng
gây độc tế bào ở mức độ trung bình với IC50 tương ứng là 19.02, 20.21 và
31.77 ỊJg/ml (đối chứng dương 5 - fluorouracil có IC50 = 5.84 |ig/ml). [4].


8 . luteolin 7 - o - ß - glucoside

9. benzyl - o - ß - D - glucopyranoside

Năm 2009, hai mươi bốn hợp chất trong đó có tám Steroid (1 - 8 ), chín
triterpenoids (9 - 16, 24), ba flavonoids (20 - 22), và bốn dẫn xuất
benzenecarboxylic (17 - 19, 23) được phân lập và xác định từ thân và cành
của cây ngập mặn Sonneratia caseolarỉs. Trong số này các hợp chất 1, 4 - 20
và 22 - 24 đã được phân lập lần đầu tiên từ loài này. Các thử nghiệm in vitro
gây độc tế bào trên dòng tế bào gan người SMMC - 7721 cho thấy hợp chất
2 1 (3’,4',5,7 - tetrahydroxyflavone) thể hiện hoạt tính tốt với IC 50 = 2,8 |ig/ml,

còn các hợp chất axit oleanolic (14), 3,3' - di - o - methyl ether axit ellagic
(18), và 3,3',4 - o - tri - o - methyl ether axit ellagic (19) có hoạt tính yếu.
Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất trên cũng được thử nghiệm trên các
chủng Candida albicans và Staphylococcus aureus, tuy nhiên không có hợp
chất nào thế hiện hoạt tính đáng kế. [5]

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

5

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khỏa Luận Tốt Nghiệp



Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

o,

o
'ơ

HO-

OH

Ò
18 R = H
19 R = CH3

17
.OH

OH
HO.

HO

'OH

chống oxi hóa.
Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

1

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.2 Các nhóm flavonoid
1.2.2.1. Flavon và flavonol
Nhóm flavon và flavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3. Công thức
cấu tạo của hợp chất như sau:

2-phenyl cromon hay 2-phenyl benzopyron

3 hydroxi flavon

Hình 1.2: Flavon và flavonol

Flavon và Aavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các
nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất
khác nhau.
Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng
tự do mà thường dưới dạng glycozit.
1.2.2.2. ĩỉa va no n (dihydroýlavon)


vài chất ở dạng glycozit. Flavanonol có hai

HO

nguyên tử cacbon bất đối là c - 2 và c - 3 nên
chúng

có

tính

quang

hoạt.

Các

hợp

chất

flavanonol - 3 thường gặp là aromadendrin, fustin
và taxifolin.
1.2.2.4. Chacol
Chacol khác với các loại ílavonoid khác là
nhóm chacol có phân tử gồm hai vòng benzen A và
B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên
tử cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu
đánh từ vòng B.
Hình 1.4: Chacol

Ö

S u n p h u r e in

C o r e o p s in

1.2.2.6. Antoxianidin
Antoxianidin thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong
nước. Công thức chung như sau:

OH

Antoxianidin
Hình 1.6: Antoxianỉdin

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

10

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.2.7. Leucoantoxianidin
Leucoantoxianidin còn gọi là ílavan - 3,4 diol. Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng
aglycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit.
Leucoantoxiandin


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

ì . 2.2.10. Rotenoid và neoflavonoid
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc
cũng như sinh tống hợp. Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử
cacbon nên có thế tạo thêm một vòng pyran thứ hai. Công thức như sau:

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung m ôi chiết
Thường thì các chất chuyến hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyến hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Neu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất
lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu
được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi
như các diankyl phtalat, tri - n - butyl - axetylcitrar và tributylphosphat. Những
chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo
quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn


hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1 - hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

13

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thế tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trường axit. Quá
trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân
tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể tạo
thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây
được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các alcaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết
chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn
chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra
và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình
chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

15

Lớp: K37A - Hóa học

thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

16

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

rioo.b.c
n " 1+b.c
n

: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n oo : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b

: Hằng số.

c

: Nồng độ của chất bị hấp phụ.



Khóa Luận Tốt Nghiệp

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,
được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đối ion (Ion exchange chromatography)
+Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học
là polymer nên gọi là hạt nhựa. Be mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học
ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography,

gel filtration

chromatography)
+ Pha động chỉ có the là chat lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bang polymer, trên bề
mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong
cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực
với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyến sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi
trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký
cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kế. Bản thân vật liệu
tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác