TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ TẤN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT
FLAVONOIT TỪ CÂY BẦN CHUA
(SONNERRATIA CASEOLARIS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Hoài Nam

HÀ NỘI - 2015


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp đƣợc hoàn thành tại Viện Hoá sinh biển. Với lòng
biết ơn chân thành, em xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS. Nguyễn Hoài
Nam, đã trực tiếp hƣớng dẫn em hoàn thành khoá luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dƣợc
liệu biển, Viện Hoá sinh biển, đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng các
thầy cô giáo trong khoa Hoá học trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận
tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt bốn năm học tại trƣờng.

1.4.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc kí ....................................................... 17
1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ ..... 21
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) ...................................... 21
1.5.2. Phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy, MS) .......................................... 22
1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy NMR) ..................................................................................... 23
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 26
2.1. Mẫu thực vật ......................................................................................... 26
2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất ....................................................... 26
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..................................................................... 26

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ................................................................... 27
2.2.3. Sắc ký cột (CC) .................................................................................. 27
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)......................................................................... 27
2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI - MS) ................................................................. 27
2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ nhân (NMR)......................................................... 27
2.4. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 27
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ............................................................. 27
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc .................................................. 28
2.5. Hoá chất ................................................................................................ 28
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................... 29

Hình 1.5: Auron .......................................................................................... 10
Hình 1.6: Antoxianidin ................................................................................. 10
Hình 2.1: Bần chua - Sonneratia caseolaris (L.) Engl. ............................... 26
Hình 3.1.a: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Bần chua Sonneratia caseolaris 29
Hình 3.1.b: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nƣớc mẫu
cây Bần chua ......................................................................................... 30
Hình 4.1.a: Phổ 1H - NMR của BCW7 ......................................................... 33
Hình 4.1.b: Cấu trúc của hợp chất BCW7 ..................................................... 34
Hình 4.1.c: Phổ 13C - NMR của BCW7 ........................................................ 34
Hình 4.1.d: Phổ HSQC của BCW7 ............................................................... 35
Hình 4.1.e: Phổ HMBC của BCW7 .............................................................. 37
Hình 4.1.f: Một số tƣơng tác HMBC của BCW7 .......................................... 38
Hình 4.2.a: Cấu trúc của hợp chất BCW5 ..................................................... 38
Hình 4.2.b: Phổ 13C - NMR của BCW5 ........................................................ 38
Hình 4.2.c: Phổ 1H - NMR của BCW5 ......................................................... 39
Hình 4.2.d: Phổ HSQC của BCW5 ............................................................... 10
Hình 4.2.e: Phổ HMBC của BCW5 .............................................................. 42
Hình 4.2.f: Một số tƣơng tác HMBC của BCW5 .......................................... 42

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Hình 4.3.a: Cấu trúc của hợp chất BCW6 ..................................................... 43
Hình 4.3.b: Phổ 1H - NMR của BCW6 ......................................................... 44


H - 1H

1

H - 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

COSY
2D - NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Two - Dimensional
NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI - MS

Phổ khối lƣợng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

FAB - MS

Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry


Phổ khối lƣợng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU
Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng đƣợc con ngƣời quan tâm và ứng
dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến môi
sinh. Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại
thuốc chữa bệnh đang đƣợc lƣu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng có nguồn gốc tự nhiên.
Bằng các phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao,
ngƣời ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các
chất đã tách đƣợc từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất
có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho việc phát

thuốc mới, các giải pháp điều trị bệnh.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Phân lập hợp các hợp chất flavonoit từ lá cây Bần chua bằng các
phƣơng pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất đã phân lập đƣợc bằng
các phƣơng pháp phổ.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

2

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về cây Bần chua
1.1.1. Giới thiệu về cây Bần chua

. Tên khoa học : Sonneratia caseolaris (Tên đồng nghĩa

- Sonneratia acida

L.f., Rhizophora caseolaris L.)

. Tên Việt Nam : Bần chua
Ngoài ra cây còn có tên : Hải Đồng, Thủy Liễu, Bằng Lăng Tía.

đắp chữa các vết thƣơng dụng dập. Ở Malaixia, lá giã lẫn với cơm dùng làm
thuốc đắp chữa bí tiểu tiện. Quả già làm thuốc diệt giun, còn nƣớc ép từ quả
xanh làm thuốc giảm ho. [1],[2]
1.1.4. Thành phần hóa học
Năm 2006, Samir Kumar Sadhu và cộng sự (Bangladesh và Nhật Bản)
công bố 2 hợp chất flavonoid từ phần lá loài Sonneratia caseolaris thu thập
tại Bangladesh, cả 2 hợp chất này đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa [3].

Luteolin

Luteolin 7 - rutinoside

Năm 2009 nhóm nghiên cứu của Shi Biao Wu (Trung Quốc) tách đƣợc
9 hợp chất từ quả cây Bần chua, trong đó 2 hợp chất nor - lignans (1, 2) và 2
dẫn xuất 6H - benzo[b,d]pyran - 6 - one (3, 4) đƣợc phần lập lần đầu tiên từ
chi Sonneratia có thể coi là các các chất “chỉ dấu” (taxonomic markers) cho
việc phân loại chi này. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế
bào u thần kinh đệm chuột C - 6 cho thấy các chất 1, 2, và 6 thể hiện khả năng
gây độc tế bào ở mức độ trung bình với IC 50 tƣơng ứng là 19.02, 20.21 và
31.77 µg/ml (đối chứng dƣơng 5 - fluorouracil có IC50 = 5.84 µg/ml). [4].

3. 3,8 - Dihydroxy - 6H benzo[b,d]pyran - 6 - one

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

4. 3 - hydroxy - 6H - benzo[b,d]pyran - 6 - one

4

Lớp: K37A - Hóa học

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

R3

R4
RO

1 R = 6-O-acetyl--D-glc
2 R = OH
3 
R = palmitate
5 R = 6-O-hexadecanoyl--D-glc
6 R = -D-glc

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

R1O
R2

9 R1 = R4 = H, R2 = CH3, R3 = CH2OH
10 R1 = R4 = H, R2 = R3 = CH3
11 R1 = R4 = H, R2 = CH2OH, R3 = CH3
12 R1 = (E)-coumaroyl, R2 = CH3,
R3 = COOH, R4 = OH
24 R1 = R4 = H, R2 = COOH, R3 = CH3

8
7
A

1
O

1'

6'

6

4'

B

2

C

3'

5'

3
5

4


2-phenyl cromon hay 2-phenyl benzopyron

Flavonol
3 hydroxi flavon

Hình 1.2: Flavon và flavonol
Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lƣợng các
nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất
khác nhau.
Trong thực vật, các flavon và flavonol thƣờng không tồn tại dƣới dạng
tự do mà thƣờng dƣới dạng glycozit.
1.2.2.2. Flavanon (dihydroflavon)
O

O

Flavanon

Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcol do vòng
dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành
chalcol.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

8

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2


Ngƣời ta đã biết đến khoảng 30 hợp chất thuộc

Hình 1.3: Flavanonol - 3
OH

nhóm này, phần lớn chúng ở dạng aglycon chỉ có
vài chất ở dạng glycozit. Flavanonol có hai

O
HO

OH

nguyên tử cacbon bất đối là C - 2 và C - 3 nên

OH

chúng có tính quang hoạt. Các hợp chất

OH

O

Taxifolin

flavanonol - 3 thƣờng gặp là aromadendrin, fustin
và taxifolin.
1.2.2.4. Chacol
Chacol khác với các loại flavonoid khác là

Chalcol

Hình 1.4: Chacol

Hiện nay ngƣời ta biết đến khoảng 20 hợp chất Chalcol, ngoài ra còn
thấy hợp chất dihydrochalcol. Tuy vậy, giữa chalcol và dihydrochalcol hầu
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

9

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

nhƣ không có mối quan hệ khăng khít nào. Chalcol có thể bị đồng phân hoá
thành flavanon khi đun nóng với axit clohydric (HCl).
1.2.2.5. Auron
Auron là hợp chất có vòng C là một dị vòng 5 cạnh. Công thức cấu tạo
chung của nhóm auron nhƣ sau:
O
A

C

CH

B

O

Sunphurein

Coreopsin

1.2.2.6. Antoxianidin
Antoxianidin thƣờng gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong
nƣớc. Công thức chung nhƣ sau:
OR

O
RO
OH

Antoxianidin
Hình 1.6: Antoxianidin

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

10

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.2.7. Leucoantoxianidin

OH

OH

OH
OH

OH

(-) epicatechin

(+)- catechin

OH

OH
O

O
HO

HO

OH

OH
OH

OH



Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

11

Iso flavanon

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.2.10. Rotenoid và neoflavonoid
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc
cũng nhƣ sinh tổng hợp. Khung cacbon đƣợc mở rộng thêm một nguyên tử
cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai. Công thức nhƣ sau:

O

H
O
O

H
O
OMe
OMe



Methanol và chlorofrom thƣờng chứa dioctylphtalat [di - (2 - etylhexyl)
- phtalat hoặc bis - 2 - etylhexyl - phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả
phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong
thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen
clorit và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của chlorofrom nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất nhƣ các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tƣơng tự nhƣ vậy, sự có mặt của lƣợng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng
có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hoá với các hợp
chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên khi làm
việc với chất này cần đƣợc thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chlorofrom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới đƣợc tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu đƣợc từ
trechlonaetes aciniata đƣợc chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1 - hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
đƣợc chiết trong methanol nóng.
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nƣớc.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc.
Chiết ngâm là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dƣới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

14

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

môi có thể nóng hoặc lạnh nhƣng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trƣớc
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.
Thông thƣờng quá trình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng
pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết đƣợc lấy ra. Thông thƣờng quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các alcaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trƣng nhƣ tác nhân

1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phƣơng pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác
nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha:
pha động và pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…).
Phƣơng pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các
chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của
sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do
khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này
đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết
quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ
thống sắc kí so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này
mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phƣơng pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

16

Lớp: K37A - Hóa học



- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng
hợp này chất khí đƣợc gọi là khí mang hay khí vectơ.
+ Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp
mỏng, sắc ký cột.
* Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân
tách chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng
này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

17

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,
đƣợc nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thƣờng sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
+Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học