TRƯỜNG ĐẠI HỌC s u PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
ĐINH THỊ HẠNH
NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG
ĐIÈU CHÉ CHITOSAN KHỐI LƯỢNG
PHÂN TỬ THẤP
KHÓA LUẬN
TỐT NGHIỆP
ĐẠI
HỌC
•
•
•
•
C huyên ngành: H óa công nghệ m ôi trư ờng
Người hướng dẫn khoa học
TS. TRẰN THỊ Ý NHI
HÀ NỘI - 2015
L Ờ I C Ả M ƠN
Trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Lê Cao Khải, cùng toàn thể
các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2,
đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa
học hữu cơ và công nghệ môi trường.
Bảng 3.3: Kêt quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan DA~0...........................34
Bảng 3.4: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ axit
khác nhau...........................................................................................36
Bảng 3.5: Ket quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở
nhiệt độ khác nhau............................................................................ 37
Bảng 3.6: Mối quan hệ giữa độ tan và khối lượng phân tử trung bình của
các mẫu L W C ................................................................................... 38
DANH MỤC CÁC S ơ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của Xenluloza, Chitin, Chitosan...........................................3
Sơ đồ 1.2: Điều chế chitosan................................................................................ 9
Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống............................10
Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan........................................... 10
Sơ dồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin .........................................................11
Sơ đồ 1.6: Quá trình thủy phân bằng enzym .................................................. 14
Sơ đồ 1.7: Thủy phân chitosan bang axit HC1 loãng.......................................15
Sơ đồ 1.8: Sơ đồ cơ chế thủy phân axit liên kết glucozitcủa chitosan. Cơ
chế được chấp nhận của quá trình thủy phânliên kếtglucozit..... 17
Sơ đồ 1.9: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl............................................... 17
Sơ đồ 1.10: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp................27
Sơ đồ 1.11: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin........................................................30
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẤT TRONG KHÓA LUẬN
Ac
: C H 3C O
: Lactic axit bacterial
Mn
: Khối lượng phân tử trung bình
Me
: CH 3
NMR
: Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân
LWC
: Chitosan khối lượng phân tử thấp
MỤC LỤC
MỞ ĐÀU.................................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cún....................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cún......................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về chitin/chitosan............................................................3
1.1.1. Cấu trúc tinh th ế ....................................................................................4
1.1.2. Tính ta n .................................................................................................. 4
1.1.3. Khối lượỉĩg phân tử ................................................................................5
3.1.3.Điều chế chitosan có DA thấp...........................................................35
3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng điều chế chitosan
khối lượng phân tử thấp..................................................................................37
3.2. 1. Anh hưởng của nồng độ axỉt HCl đến khối lượng phân tử
trung bình ( Mn) sảnphấmphản ứng đềpolyme hoảchitosan................. 37
3.2.2. Anh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phần tử trung bình
( M n) sản phắm phản ứng đềpoỉyme hoả chitosan..................................39
3.2.3. Đảnh giả độ tan trong nước của các mâu chỉtosan trọng lượng
phân tử thấp..................................................................................................40
3.3. Xác định cấu trúc của chitosan khối lượng phân tủ’ thấp...................... 40
KẾT LUẬN CHUNG......................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................44
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Chitin
[poly-P-(1^4)-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ],
một
polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau xenlulozơ,
là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm, mai cua,
mai mực...
Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc biệt: Tính hòa hợp
sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống độc... Do
đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược phẩm, nông nghiệp, mỹ
phẩm, công nghệ môi trường... Mặc dù vậy khả năng ứng dụng này còn hạn
Chế tạo ra được chitosan khối lượng phân tử thấp có khả năng hòa tan
trong nước.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Điều chế chitin, chitosan từ mai mực ống;
- Khảo sát các điều kiện phản ứng để điều chế oligochitosan (LMC):
ảnh hưởng của nồng độ axit, nhiệt độ phản ứng..
- Khảo sát một số tính chất hóa lý của sản phẩm.
2
CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về chitin/chitosan [1,2,4,15,21]
Trong số các polysaccarit thì xenlulozo và chitin là nguồn tài nguyên
sinh học tự nhiên phong phú nhất. Xenlulozo được tổng họp từ thực vật còn
chitin được tổng họp chủ yếu từ động vật bậc thấp. Chitin có cấu trúc tương
tự như xenlulozo, tên gọi “chitin” xuất phát từ tiếng Hilap “chiton” nghĩa là
vỏ của các loài giáp xác như cua, tôm, mai mực.....
Chitin được đánh giá là loại vật liệu có tiềm năng lớn nhưng cho đến
này việc ứng dụng chitin vẫn chưa được rộng rãi như xenlulozo. Chitin không
chỉ là nguồn tài nguyên sẵn có mà nó còn là một loại vật liệu chức năng do
chitin là một polyme sinh học với nhiều tính chất quý báu như khả năng phân
hủy sinh học và đặc biệt là có hoạt tính sinh học.
Xenlulozo
Chitin
Chitosan
- a-chitin: cấu trúc tinh thể mạng ghép đôi song song (một mạng lên
một mạng xuống liền nhau), a-chitin thường được tách từ vỏ cua.
- ß-chitin: các mạch ghép trong tinh thế theo cách ghép song song cùng
chiều, ß-chitin chủ yếu có trong mai mực nang sừng.
- y-chitin: có mạch ghép trong tinh thể theo 2 cách, cứ 2 mạch song
song lại có 1 mạch đối song, y-chitin được tách từ sợi kén của bọ cánh cứng,
dạ dày của mực ống, là loại có trữ lượng ít nhất.
1.1.2. Tính tan [21,27]
Chitin thể hiện ái lực hạn chế với phần lớn các dung môi vì có liên kết
hidro chặt chẽ giữa các phân tử. Chitin thường (a-chitin) không tan và hầu
4
như không trương trong dung môi thông dụng mà chỉ tan trong một số dung
môi đặc biệt, ví dụ: N,N-dimetylaxetamit (DMAC) có chứa 5-10% LiCl.
Chitosan là một polyamin không tan trong nước cũng như trong dung
môi hữu cơ nhưng tan trong môi trường axit loãng. Độ tan của chitosan phụ
thuộc vào độ axetyl hóa, loại axit và nồng độ axit trong dung dịch. Khi xử lý
chitin/chitosan trong môi trường axit mạnh với nồng độ lớn thường xảy ra
phản ứng depolyme hóa (cắt mạch) làm giảm khối lượng phân tử polyme.
1.1.3. Khối lượng phần tử [21]
Khối lượng phân tử chitin/chitosan là thông số quan trọng nhưng khó
có thể xác định được chính xác do tính tan kém của chúng và sự đa dạng về
kiểu phân bố các nhóm axetyl cũng như mức độ axetyl hóa. Độ dài mạch
chính của chitin/chitosan có thể giảm trong quá trình xử lý với axit và kiềm.
Khối lượng phân tử chitin sau khi tách khỏi protein cũng như các chất khác
được tính toán theo các phương pháp đo độ nhớt, sắc ký thẩm thấu gel (GPCGel Permeation Chromatography) hoặc sắc ký loại trù’ theo độ lớn phân tử
(SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi DMAc/LiCl. Ket
họp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt thì có thể xác định
T: nhiệt độ tuyệt đối
1.1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,15,18]
Độ axetyl hóa là hàm lượng nhóm (-N H C O C H 3) còn độ đeaxetyl hóa là
hàm lượng nhóm (-NH2) trong chitin và chitosan. Mắt xích cơ sở của chitin là
N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc). Mặc dù hầu hết các nhóm amino gắn với
c 2 đã bị axetyl hóa, nhưng trong tự nhiên chitin vẫn tồn tại một số nhóm
amino tự do. Hơn nữa, phản ứng đeaxetyl hóa chitin còn xảy ra trong quá
trình tách loại protein bằng kiềm. Vì vậy, các mẫu chitin trên thực tế có DDA
khác nhau (khoảng 5 - 15%) phụ thuộc vào nguồn gốc và cách điều chế
chúng. Để thu được chitin có cấu trúc thuần nhất (chỉ gồm các mắt xích
GlcNAc) thì phải tiến hành N-axetyl hóa chọn lọc các nhóm amino tự do. Khi
6
chitin bị đeaxetyl hóa đáng kể thì trở nên tan trong dung dịch axit axetic loãng
và được gọi là chitosan.
Trong đó, DDA = 100-DA. Đối với chitin thì DA > DDA, đối với
chitosan thì DA < DDA. Khi DA = DDA thì có chitin tan trong nước.
Tính chất của chitin cũng như chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ
đeaxetyl hóa (DDA) - một thông số quan trọng nhất để chỉ ra là chitin hay
chitosan. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp xác định DDA (hay DA) một cách
chính xác và đơn giản là vấn đề rất quan trọng và cần thiết. Có rất nhiều
phương pháp đã được áp dụng để xác định DDA của chitin/chitosan như:
phân tích nguyên tố, các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử
ngoại (ƯV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM): 'H-NRM, l3C-NRM, và
l5N-NRM ở trạng thái rắn, cho phép đo lưỡng sắc cầu, phổ khối, chuẩn độ
điện thế, chuẩn độ nitrat (phương pháp chuẩn độ sử dụng bạc nitrat), chuẩn độ
tác nhân oxi hóa. Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch
đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa.
Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như
phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô
nhiễm môi trường. Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm
mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau.
Theo phương pháp x ử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các
loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi
khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ
phế thải (vỏ tôm, cua, mai mực...) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn
LAB thuần chủng được bổ sung có tác dụng bảo quản và thủy phân phế
8
thải.Hỗn họp lên men bao gồm: vỏ phế thải, LAB, dung dịch glucozo. Trong
quá trình lên men, LAB sản sinh ra axit lactic làm giảm pH của môi trường,
tạo điều kiện cho quá trình thủy phân protein, thủy phân khoáng tạo thành các
lactat canxi, magie... là các muối tan được trong nước. Bằng phương pháp ly
tâm, phần dung dịch lỏng chứa protein và các muối khoáng hòa tan được loại
bỏ thu được phần chitin không hòa tan. Đe có chitin sạch, có thể xử lý tiếp
bằng dung dịch axit và kiềm loãng.
Phương pháp điều chế chitin bằng phương pháp lên men vi sinh vật có
một số ưu điểm như chi phí thấp, cấu trúc sản phấm không bịthay đổi nhiều
và đặc biệt là ít gây ô nhiễm môi trường.
(3-chitin được sản xuất chủ yếu từ mai mực ống theo cách đơn giản hơn
vì thành phần của mai mực ống chủ yếu là chitin, hàm lượng protein và muối
khoáng thường rất thấp. Hơn nữa, do sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong
p-chitin khác hẳn với a-chitin nên a-chitin có cấc liên kết hidro chặt chẽ hơn,
vì vậy khi xử lý mai mực ống với axit và kiềm thường ở điềukiện êm dịu hơn
ị
Chitin
ị
Deaxetyl hóa (bằng NaOH 50%, trong vòng 2h ở 100°C)
ị
Chitosan
S ơ đo 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thong
1.3. Tính chất hóa học [1,2,5]
Công thức tổng quát của chitin là: (CgH^NOs),!
10
,OH
>OH
^0
NHAc
nh 2
n
S ơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan
Ta thấy trong mỗi mắt xích của chitin/chitosan vừa có nhóm chức
(-OH) vừa có nhóm chức amin (-NHCOCH 3/NH 2 ) nên có ba trung tâm phản
ứng chính, vì vậy nó vừa có tính chất của ancol lại vừa có tính chất của amin.
1.3.1 Phản ứng ở nhóm -O H
Phản ứng với axit, anhidric axetic hay HC1 thu được sản phẩm ở dạng
phản ứng là chuỗi polyme vẫn có cả mắt xích N-axetyl-D-glucozamin đan xen
với p (1—>4) glucozamin.
Đẻ đánh giá mức độ đeaxetyl hóa của chitin người ta đưa ra khái niệm
độ đeaxetyl hóa (DDA) được tính theo công thức sau:
203(100-A )
DDA=
203(100-42A)
' 100%
Với A là tổng số % mắt xích N-axetyl-D-glucozamin
Muốn thu được chitosan đeaxetyl hóa hoàn toàn DDA ~ 0, phải rửa
sạch mẫu rồi xử lý kiềm lặp lại nhiều lần.
1.3.3. Phản ủng ở nhóm -N H 2
Phản ứng xảy ra ở nhóm amin -N H 2 và nhóm amit - N H C O C H 3 hai
nhóm này gắn ở vị trí c 2 (hay ở vị trí N). Tại đây nhóm -N H 2 của
chitin/chitosan có đôi điện tử không phân chia do đó về mặt hóa học, chúng
có khả năng phản ứng cao với các tác nhân ái lực electron để tạo ra các dẫn
xuất tương ứng.
Phản úng gắn với các nhóm -OH tại C3 (hoặc c 6) hay gắn polietylenglycol
vào nhóm -N H 2 thu được các dẫn xuất có cấu trúc hóa học cồng kềnh nhằm
cản trở không gian, làm giảm các liên kết cầu hidro giữa các mạch và trong
mạch phân tử của chitin/chitosan như lúc ban đầu, để tạo ra các dẫn xuất tan
trong nước.
1.3.4. Phản ửng cắt mạch chitosan
Do quá trình chuyển hóa trong động thực vật chủ yếu xảy ra trong môi
trường nước nên chitosan với khả năng tan kém trong nước đã làm hạn chế
12
lọc thu hồi sản phẩm.Tiến hành đo độ nhớt (r|) đồng thời xác định khối lượng
phân tử trung bình ( A / „) của sản phẩm. Cơ chế của quá trình chiếu xạ:
R - H ^ > R ’(Ct +Ct )+ H ’
R - H + H ' ->R'(C, +C6)+ H 2
r
-( c ^
c 4)
^
f;
+
f2
R - NH2 + / / • - > R'(C2)+ NH3
Trong đó R-H và R-NH 2 là các phân tử chitosan có khối lượng phân tử
lớn, R*{c„) là gốc chitosan khối lượng phân tử lớn nằm trong nguyên tử
cacbon c n, F*,F2 là phần của chuỗi chính. Sau khi bị bẻ gãy, độ nhạy chiếu
xạ của phân tử polyme cho trước có thể được đánh giá từ hiệu suất depolyme
chiếu xạ của nó.
Phương trình của Charlesby Pnner:
= Gứfx1,04x10'7 x Đ
yM n
pectinaza). Cho dung dịch enzym vào, lượng enzym được tính theo lượng chất
tan (chitosan). Dừng phản ứng cắt mạch sau 3^-30 giờ (tùy từng loại enzym)
bằng cách đun sôi dung dịch phản ứng trong 10 phút để tách bỏ enzym. Tiến
hành lọc, dung dịch sau khi lọc được trung hòa bằng NaOH10%, pH đạt giá
trị pH=9. Tiến hành ly tâm thu được phần kết tủa, rủa sản phẩm kết tủa bằng
etanol nhiều lần. Sản phẩm lại được tách bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC để
phân đoạn.
Quá trình thủy phân khi có mặt pectinaza (chiết từ nấm cúc màu nâu
sẫm) ở pH=3, nhiệt độ 37°c làm cho độ nhớt của dung dich giảm nhanh.
Oligome thu được trong quá trình này có khối lượng phân tử dao động trong
15
khoảng 20,000-ỉ-5000 Da. Chitosan khối lượng phân tử thấp có độ kết tinh cao
hơn và đa dạng hình hơn chitosan.
1.3.4.3. Phương pháp hóa học
•
Phương pháp thủy phân axỉt:
Г
_
xOH
Г
-
Sự thủy phân của liên kết glucozit (depolyme hóa) và liên kết N-axetyl
của chitosan được nghiên cứu trong HC1 đặc, HC1 loãng. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy, tốc độ thủy phân của kiên kết glucozit tương đương với tốc độ
16
đề N-axetyl hóa trong axit loãng. Trong khi đó thì liên kết glycozit được thủy
phân nhanh hơn 10 lần so với liên kết N-axetyl trong HC1 đặc. Điều này có
thể giải thích bằng cách giả sử rằng, quá trình thủy phân của liên kết N-axetyl
là phản ứng Sn2, trong khi thủy phân của liên kết glucozit là phản ứng SN1,
với bước làm giảm vận tốc là sự hình thành cacbocation.
17
Copyright: Tài liệu đại học ©