Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện
của gen ngoại laiI. Southern blot
Southern blot là một trong những phương pháp trung tâm của Sinh học phân
tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern blotting, phương pháp lai Southern hay
phương pháp lai DNA .
Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả năng tiếp
nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứu lai axit
nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. Vào thời kỳ này DNA cố
định không được phân đoạn, chỉ đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn trên
màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu thập
niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được
phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ đó bước phát triển tiếp theo
của phương pháp là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai
nitrocellulose. Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tại Ðại học
Edingburgh vào năm 1975. Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả.
Mặc dù đã được cải tiến nhưng phương pháp đang được sử dụng ở nhiều phòng
thí nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương pháp ban
đầu.
Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
-Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
-Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
-Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel): ví dụ có thể nhúng
nó vào trong dung dịch NaOH 0.5M, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi
đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
-Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Thông thường màng lai được sử
dụng là màng nitrocellulose. Người ta cũng có thể sử dụng màng nylon. Màng
nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm
2

-RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng điện di trên gel
agarose.

Hình 3.1: Sơ đồ mô tả phương pháp Southern
blot

-RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ
nguyên vị trí như ở trên gel).
-RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có
đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc
horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi
kép.

Hình 3.2: Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot

-Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được
đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ
với một cơ chất không màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản
phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng
phim X quang một cách trực tiếp.
Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác định kích
thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA ở trong các mẫu khác nhau. Ðây là
một phương pháp rất tốt để phân tích sự biểu hiện của gen khi chúng ta cần định
lượng để phân biệt sự khác nhau giữa hai mẫu và nó rất nhạy bởi vậy chúng ta có
thể điện di một lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel.

III. Western blot
Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của
kháng thể để phát hiện protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE (sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng lai.

tốn nhiều thời gian hơn và mở rộng phạm vi phương pháp phát hiện virus cũng
như các marker liên quan đến sự nhiễm của chúng.
Xét nghiệm ELISA có thể được tiến hành với một số phương pháp như
ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ và “cạnh tranh“.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan
trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene).