Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA ENZYM LIPASE
Enzym thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các
tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển
của lipit từ cơ quan này sang cơ quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ
enzym thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho các phản ứng lý hố tại bề
mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt (kiểu xúc tác
sensu stricto). Hầu hết enzym Lipase là enzym hồ tan được trong nước hoạt
động trên những cơ chất khơng tan trong nước. Đặc tính phức tạp của loại xúc
tác này làm cho nó khó định lương đươc chính xác cả về tỷ suất bề mặt cũng
như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực căng bề mặt, tính
nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất
mà q trình phân ly chất béo phải phụ thuộc. Sự nhũ hố giữa nước và các
chất khơng tan trong nước sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt
như: các chất tẩy rửa, các chất béo khác nhau, protein… ngay tại bề mặt giao
tiếp giữa hai pha, vì vậy có thể ảnh hưởng một cách mạnh mẽ đến phương
pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm khơng đặc hiệu của lipase
do sự xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví
dụ điển hình.
Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được
dựa trên hiện tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng
hoạt tính xuất hiện khi một phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất
khơng tan trong nước. Q trình này chưa được quan sát trên các esterases
( nhóm enzym xúc tác sự tổng hợp và thuỷ phân các ester ). Cấu trúc 3-D của
lipase được xác định gần đây cho thấy các nếp gấp α/β của hydrolase và tâm ái
nhân có chứa gốc Serin. Một số lipase ( khơng phải là tất cả ) còn có vùng
kieểm sốt trung tâm hoạt động và hiện tượng “ hoạt động bề mặt “chưa phải
là tiêu chuẩn thích hợp để phân loại các esterases đặc biệt như lipase. Vì các
enzym thường được đặt tên theo kiểu phản ứng mà chúng xúc tác, lipase có thể
được định nghĩa lại là các carboxy-esterases hoạt động trên chuỗi

cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzym nhất định.
3. Chọn nồng độ enzym cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất
định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Ba nhóm phương pháp này được tóm tắt trong bảng sau :
Nhóm Các thơng số cố định Các thơng số thay đổi
1 Thời gian
Nồng độ enzym
Biến thiên của S hay P
2 Lượng cơ chất mất đi (hay
lượng sản phẩm tạo thành).
Nồng độ [E]
Thời gian
3 Thời gian
Lượng S mất đi (hay P tạo
thành)
Nồng độ E
Có thể tìm thấy trên các bài báo, tạp chí khoa học nhiều phương pháp để đo
hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase. Những phương pháp này có thể được
phân loại như sau :
1. Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry )
2. Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry ))
3. Phương pháp sắc ký ( Chromatography )
4. Phương pháp phóng xạ ( Radioactivity )
5. Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry )
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
6. Phương pháp đục kế ( Turbidimetry )
7. Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry )
8. Phương pháp hố học miễn dịch ( Immuno-chemistry )
9. Phương pháp hiển vi ( microscopy )
….

Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử
dụng một dung dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl
2
, và sử dụng esterase
từ Lysobacter enzymogenes làm nguồn enzym. Phản ứng được theo dõi bằng
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước sóng 500nm vì q trình thuỹ phân
giải phóng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của chúng dưới dạng
muối Canxi.
Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính
riêng của enzym lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87
IU.mg
-1
) và chủng Candida cylindracea ( với liều lượng là 0.5 IU.mg
-1
).
II. Phương pháp đĩa Wilhelmy:
II.1. Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:
Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film
đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của khơng khí -nước đã được phát triển rộng
và được nhóm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như
nhóm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ bản gồm một lớp Teflon
( lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đó là một dung dịch. Một bản mỏng
Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một
electromicrobalance để đo áp suất bề mặt mà nó trực tiêp` liên quan đến sức
căng bề mặt.
Một vài cơng ty đã có sẵn thiết bị này và được thương mại hố: KSV
( Helsinki, Finland ), Kruss GmbH ( Hamburg, Germany ) và Kibron Inc
(Helsinki, Finland). Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và
Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở
mật độ bề mặt khơng thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu
diễn trong hình Fig 1A.
Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order “
để ngăn truyền thơng bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng
(reaction compartment). Áp suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách
đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn hợp film được phân bố ở
áp suất u cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới màng chứa,
nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của
màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển
lớp màng chắn di động. Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzym được tiêm vào trong bộ phận phản
ứng và kết quả động học được ghi chép như mơ tả.
II.3. Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:
Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo
rằng giá trị tối ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá
trị chính xác của điểm tối ưu biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzym và cơ
chất được sử dụng. Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích
hiện tượng này là: Giả thuyết đầu tiên, được đề nghị bởi Hughes và những
người làm việc thuộc thế hệ sau ơng: Sự định hướng phụ thuộc màng bao của
cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hồ mà q trình phân giải chất
béo phụ thuộc.
Sử dụng những enzym đã được đánh dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết
lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp
suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của
enzym. Thật vậy, sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system)
nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỉ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều
trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là 1 cm

-1
và sự vượt mức của enzym ở bề mặt bằng
đơn vị mg.cm
-2
. Ta dễ

dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzym
thường được đo bằng đơn vị là mol.min
-1
.
mg
-1
( IU.mg
-1
).