CÁC PHƯƠNG PHÁP
CÁC PHƯƠNG PHÁP
XÁC
XÁC
ĐỊNH TRÌNH TỰ
ĐỊNH TRÌNH TỰ
CỦA acid nucleic
CỦA acid nucleic
Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong
Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong
các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic
các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic
nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của
nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của
nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì, có chức
nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì, có chức
năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thông tin này chỉ
năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thông tin này chỉ
có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của acid
có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của acid
nucleic.
nucleic.
Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương
Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương
pháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phương pháp
pháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phương pháp
enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhâu

cung chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng năm phân đoạn
trên được đen đi phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí của các
oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được
phát hiện nhờ đầu đánh phóng xạ. Kết quả được đọc trên bảng phóng
xạ tự ghi
II-Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các
dideoxynucleotide của Sanger
Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerase
mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc trương của
phương pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn
loại dideoxynucleotide là những loại deoxynucleotide trong đó nhóm 3′OH
được thay bằng H. Điều này khiến các didoxynucleotide không còn khả năng
hình thành các nối phosphatdiester và do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp.
Trình tự ADN cần được xác dịnh phải được tạo dòng trong một vecter
mạch đơn (phage M 13). ADN polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của
ADN polymerase I, Taq polymerase hay Sequanase. Sự tổng hợp mạch mới
bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M 13, với
sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu đồng vị
phóng xạ (35S). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn
riêng. Người ta lần lượt cho vào mỗi phân doạn một trong bốn loại
dideoxynucleotide với hàn lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng
mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp một
oligonucleotide; và lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngùng lại. Tính xác
suất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các cỡ oligonucleotide ứng với
tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên ADN. VD : nếu trình tự DNA cần
xác định là AATCGATAGGCTTGCATG thì trong phân đoạn có mặt
dideoxynucleotide ddC sẽ có sự tổng hợp các oligonucleotide sau:

Sau khi điện di trên gel polyacryl amide, kết quả sẽ
được đọc qua một hệ thống vi tính.
Tất cả các phương pháp vừa kể đều dùng để
xác định trình tự của một DNA đã được tạo dòng.
Sự ra đời của phương pháp PCR cho phép xác
định trực tiếp trình tự của một DNA khuyếch đại
bằng PCR không qua tạo dòng.