CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 68
Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI
ENZIM
(Copfacto: cht phi hp hay cht cng tác ca enzim
DEAE – celluloza: diethylamino – athylcelulose)
7.1. n vo hot :
c  hot ng ca enzim trong ch phm là thông tin quan trng v lng enzim
trong i tng nghiên cu, vì rng trong nhng u kin xác nh, tc  phn ng
enzim t l vi lng enzim trong hn hp phn ng. Lng enzim theo quy c quc t
c biu din bng n v enzim:
n v tiêu chun enzim là lng enzim có kh nng xúc tác chuyn hóa 1 micro mol
 cht sau 1 phút  nhng u kin xác nh cho trc
- Trong trng hp enzim ch phân gii mt s liên kt ca phân t c cht (ví d
proteinaza vi c cht protein, amilaza vi c cht tinh bt) thì n v hot  tiêu chun
a enzim không tính micromol c cht b chuyn hoá mà tính bng micromol ng
ng ca các nhóm tng ng c to thành. Tc là tính theo s liên kt (peptit hay
glucozit) b phân gii.
- Trong trng hp phn ng gia 2 loi phân t theo kiu thì
n v enzim là lng enzim xúc tác chuyn hóa 1 micromol c cht A hoc B, hoc 2
micromol c cht A (hoc B) nu A=B sau 1 phút.
- Khi xác nh hot  enzim trong pha lng (dch th) thì tính sn v enzim trong
100 ml.
-  cht dùng các n v dn xut ca n v biu din: mili n v, kilô n v.
- Trong quá trình tách và làm sch (tinh ch) enzim thì ánh giá hiu qu ca quá
trình này, ngi ta dùng n v hot riêng: ó là sn v enzim tính trên 1 mg protein.
n v này ánh giá mc  thun khit ca enzim.
- u bit chính xác trng lng phân t ca enzim thì có th xác nh c hot 
phân t ca nó: là s phân t c cht (hoc sng lng các nhóm tng ng) b
chuyn hoá di tác dng ca 1 phân t enzim sau 1 phút.
- u bit c s trung tâm hot ng trong phân t enzim có th bit c hot  ca

hoá sinh (kim loi, gc axit, baz...) cn phi  enzim vi c cht có yu t kho sát
trong thi gian  lâu (>1h).
+ Khi xác nh hot  enzim, bên cnh mu thí nghim (enzim tác dng vi c
cht) cn làm mu kim tra (kim chng, mu trng) trong ó enzim ã b mt hot ng
(hoc không có enzim) trc khi tip xúc vi c cht. Mu này cng thc hin ging mu
thí nghim nhng ch khác là phi vô hot (ình ch hot ) enzim hoc là không thêm
enzim. Hot  enzim c tính bng hiu s lng c cht (hay sn phm phn ng)
gia mu thí nghim và kim tra.
7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim:
Có th phân chia thành 2 loi phng pháp: liên tc và gián n.
- Phng pháp liên tc: s dng máy móc, thit bc bit hot ng tng liên tc
(chun , so sánh, o c) vi c cu tng ghi li liên tc s bin i ca các cht và
các thông s phn ng (hin th bng bng, biu,  th, biu , enzim ...) trong sut
thi gian tác dng ca enzim.
Nh vy phng pháp này có nhiu u m, hoàn toàn tng, có kt qu ngay, cùng
t lúc có th có nhiu mu theo mt chng trình nh sn. ây là xu hng và thc
tin hin nay vi công ngh cao (high – tech)
- Phng pháp gián n: cho enzim tác dng vi c cht, sau nhng khong thi gian
nht nh thì ly mu phn ng  phân tích kt qu.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 70
Có th gi phng pháp này là phng pháp cn nhng hin nay vn còn c s
ng ph bin trng nghiên cu thm dò, s b, thí nghim i cng, nh tính. Ch có
t s ít thao tác vi enzim tinh khit c xem là hin i.
Sau ây ta xem xét mt s phng pháp c th.
7.2.1. Phng pháp o  nht:
Thng dùng c cht ca enzim có  nht ln hn (hoc nh hn) sn phm phân
hu ca nó. S bin i  nht này là thc o hot  enzim. Phng pháp này thng
dùng  xác nh hot  enzim thu phân cho amylaza, proteinaza.
7.2.2. Phng pháp phân cc k:

th hin hot  ca nó) li to thành hoc hp th khí.
Ví d: - Các phn ng to axit hu c do enzim oxy hoá kh lipaza xúc tác có th
dung dch m bicacbonat (HCO
3
-
)  to thành CO
2
(theo phn ng
- Các phn ng deamin hoá di tác dng ca enzim peptithydrolaza, sau phn ng
cho tác dng vi axit nit to thành N
2
- Các phn ng lên men cn (ym khí và hiu khí) có th thc hin trong bình
Enron, hp th CO
2
bng dung dch BaSO
4
.
7.2.4. Phng pháp ph quang k:
Thng dùng  xác nh hot  các enzim mà c cht, coenzim hoc sn phm phn
ng có kh nng hp th ánh sáng khác nhau  nhng bc sóng xác nh. S bin i 
p th bc sóng y trong quá trình phn nh là o hot  enzim. Phng pháp này
c s dng rng rãi  nghiên cu các enzim thuc nhóm oxy hoá kh
oxydoreductaza, chng hn:
- Các ehydrogenaza vi coenzim NAD
+
hoc NADP
+
. Tc  phn ng enzim c
xác nh theo mc  kh hoc oxy hoá coenzim ca chúng. Dng kh NADH, NADPH
và dng oxy hoá ca các coenzim này khác nhau rõ rt v kh nng hp th bc sóng

(enzim hay mt tác nhân khác) tác dng làm sn phm phm ng  thay i s hp th.
7.2.5. Phng pháp chun  liên tc:
c dùng  nghiên cu các phn ng enzim mà kt qu ca nó to thành axit hoc
baz. Lúc ó dùng thit b tng thêm kim hoc axit vào  gi pH môi trng phn
ng cnh, ng thi tng ghi ng biu din lng kim hoc axit ã tiêu tn vào
phn ng trung hoà. Lu lng kim hoc axit này phn ánh tc  phn ng enzim.
Phng pháp này có thc mô t m rng ra  nghiên cu các i tng khác
nhng trên nguyên tc liên tc nh lng (sn phm to thành hay lng c cht tiêu
hao), chng hn gián tip o th oxy hoá kh vi n cc tiêu chun khi nghiên cu các
enzim oxy hoá.
7.2.6. Phng pháp sc ký:
ây là phng pháp hin i, hin nay c s dng rt nhiu và trong nhiu trng
p dùng  tinh ch enzim. Tt c các phng pháp sc ký u có th áp dng  xác
nh hot  enzim. T phng pháp lâu i nht nh sc ký giy, sc ký trao i ion cho
n các phng pháp hin i nh sc ký lng cao áp, sc ký khí kt hp vi các phng
pháp phân tích hin i khác (phân tích axit ami tng, cng hng t ht nhân, cc
ph). Lng enzim và c cht cng nh sn phm phn ánh rt ít cng cho kt qu chính
xác, nhanh chóng.
7.2.7. Phng pháp hoá hc:
Dùng các phn ng hoá hc khác nhau  nh lng c cht b hao ht hoc sn
phm phn ng to thành di tác dng ca enzim. Các phn ng này thuc loi at màu
c trng, to màu vi thuc thc trng, ....nói chung là mt du hiu  nói lên mc
 hay thi m kt thúc phn ng. (ví dm tng ng khi nh phân axit – baz
c xác nh bi si màu fenolftalein, quì tím...)
Trong tt c các phng pháp va nêu, tu theo u kin, yêu ccu nghiên cu thc t
mà quyt nh phng thc tin hành (chng hn tin hành trong u kin thi gian nh
nhau, hay nng  enzim, nng  c cht không i ...) qui hoch thc nghim  xác
nh các thông s ti u.
7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho.
Ch phm enzim có th dng rn, lng, bao gm giá th (c cht, cht n, ht cc)

4
)
2
SO
4
, axeton...) và hc  nhn c dung dch trong sut
Trong trng hp sau khi xác nh xong hot  ca dch chit cn tính toán hot 
a ch phm ban u (qui v hàm lng cht khô tuyt i)