ĐẶT VẤN ĐỀ
Cho tới nay chẩn đoán mô bệnh học vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng
trong việc xác định bệnh. Trong khoảng hai thập niên trở lại đây, với sự phát
triển nhanh của khoa học công nghệ trong lĩnh vực thăm dò chẩn đoán như
nội soi, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ, nuôi cấy tế bào,
bảo quản và ghép mô…đã tạo điều kiện cho sinh thiết chẩn đoán mô bệnh học
phát triển cả về số lượng lẫn quy mô. Trong đó, bộ ba chẩn đoán gồm siêu âm
– nội soi – sinh thiết đã trở thành mũi nhọn quan trọng. Sự phát triển này đã
ngày càng khẳng định vị thế của lĩnh vực chẩn đoán mô bệnh học, góp phần
chẩn đoán sớm nhiều tổn thương và nó rất hữu ích cho chẩn đoán và điều trị
cũng như phòng bệnh. Một xét nghiệm mô bệnh học thường được tiến hành
theo một chuỗi kỹ thuật liên hoàn bao gồm: 1).Lấy bệnh phẩm, cắt lọc; 2).Cố
định bệnh phẩm; 3).Gửi xét nghiệm; 4).Vùi bệnh phẩm; 5).Cắt mảnh và dán;
6).Nhuộm; 7).Đọc kết quả. Mỗi khâu đều có những yêu cầu riêng và liên quan
rất mật thiết với nhau, ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả chẩn đoán mô bệnh
học. Trong các khâu kể trên thì khâu đầu và cuối được thực hiện bởi các bác
sĩ chuyên khoa, các khâu còn lại đều được thực hiện bởi các kỹ thuật viên giải
phẫu bệnh làm việc trong labo. Tùy theo mục đích và yêu cầu của xét nghiệm
mà việc xử lý kỹ thuật ở từng khâu có những điểm khác nhau và có những
quy trình riêng.
Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE) là kỹ thuật phổ biến nhất
trong các kỹ thuật mô học cũng như mô bệnh học, vì hầu hết các chẩn đoán
mô bệnh học đều chỉ cần và (hoặc) phải dựa vào kỹ thuật này. Vì vậy nó được
gọi là kỹ thuật thường quy cho mọi loại xét nghiệm mô bệnh học trong labo
giải phẫu bệnh.
1
Hiện nay, xét nghiệm mô bệnh học ở các cơ sở y tế trung ương trung bình
có tới gần 50% trường hợp sai sót các loại trong các khâu kỹ thuật và làm
giảm chất lượng chẩn đoán, trong đó khoảng 10% xét nghiệm âm tính hoặc
chẩn đoán sai vì lý do kỹ thuật (3). Xuất phát từ tính thực tiễn của kỹ thuật
nhuộm HE nhằm đảm bảo chất lượng trong chẩn đoán mô bệnh học, là một

cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở
Mexico.
Bản thân Hematoxylin không có đặc tính nhuộm, mà nó phải trải qua
quá trình oxy hóa để biến thành Hematein mới nhuộm được: đó là hiện tượng
“Hematoxylin đã chín”. Sự oxy hóa này xảy ra do để dung dịch nhuộm từ 6
ngày đến 3 tuần để mở dưới ánh sáng mặt trời hoặc bằng các tác nhân gây oxy
hóa như: iodat sodium, permanganat, potassium, oxytmereua. Trong quá trình
chín Hematoxylin (C
16
H
14
O
6
) mất 2 nguyên tử H để trở thành Hematein
(C
16
H
12
O
6
) có sự sắp xếp kiểu quinoit trong vòng dưới đây:

H×nh 1.C«ng thøc cña Hematoxylin H×nh 2.C«ng thøc cña Hematin
Sự oxy hóa liên tục của Hematein sẽ có hình thành một hợp chất không
màu, chính vì vậy mà một số người cho rằng quá trình oxy hóa chậm một cách
tự nhiên tốt hơn là sự oxy hóa bằng chất hóa học. Phản ứng do chất hóa học sẽ
gây nên sự oxy hóa Hematein tức khắc và quá trình oxy hóa cứ tiếp tục nên
hình thành một hợp chất không màu, làm cho dung dịch nhuộm không lâu bền.
Hematein bản thân ít ưa các tổ chức, vì vậy nên phải dùng một chất gắn
màu thường là aluminium dưới thể alun (alun ammoniac, potassium hay sắt):

Với nguồn gốc và đặc tính đặc biệt như vậy nên kỹ thuật nhuộm
Hematoxylin được tiến hành như sau:
1.3. Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt và dán mảnh,
nhuộm tiêu bản H&E:
1.3.1. Kỹ thuật cố định
Cố định là làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như của tế bào
nhưng vẫn tồn tại tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định
một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản
chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất. Trừ một số trường hợp cần
nhuộm tươi hay cần nghiên cứu về men, nuôi cấy tế bào thì nói chung, mọi
bệnh phẩm cần cố định ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể. Nếu như ta cố định
bệnh phẩm không tốt thì sẽ làm giảm chất lượng xét nghiệm còn cố định hỏng
thì không thể sửa chữa được.
Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi cơ thể sẽ gây ra thoái hóa, hoại tử giả tạo
khi nhận định, các tế bào sẽ bị tiêu hủy bởi men nội bào, hình thái của chúng
trở nên méo mó và sẽ sinh ra những hình ảnh giả tạo gây nhầm lẫn trong
chuẩn đoán. Mặt khác, việc cố định chậm sẽ gây tiêu hủy các bào quan,
không có lợi cho các nghiên cứu về men học đồng thời cũng không đảm bảo
cho việc gắn màu tốt khi nhuộm.
Một bệnh phẩm được cố định tốt phải đảm bảo những nguyên tắc sau:
1. Mọi bệnh phẩm phải được cố định ngay sau khi lấy.
2. Không được làm dập nát bệnh phẩm.
3. Bệnh phẩm không cắt quá dày.
4. Đủ lượng dung dịch cố định cần thiết.
5. Thời gian cố định dung dịch thích hợp.
6
6. Không để bệnh phẩm dính vào thành lọ.
7. Chú ý những trường hợp cố định đặc biệt:
- Glycogen: cố định bằng dung dịch Grendre.
- Mỡ: cố định bằng dung dịch formol 10%, cắt lạnh và nhuộm

lại trên một vị trí của bệnh phẩm và bệnh phẩm khi pha phải được đặt trên
một miếng lie, gỗ hoặc plastic.
Các mẫu bệnh phẩm dùng trong kỹ thuật mô học thường được cắt dày từ
3 - 5 mm. Với bệnh phẩm mềm (não,…) có thể cố định vài giờ cho cứng sau
đó mới pha lại. Trong trường hợp chuyển đúc bằng máy, bệnh phẩm không
được cắt dày hơn chiều cao của lòng khuôn nhựa.
1.3.3. Vùi bệnh phẩm
Cấu trúc tế bào hoặc mô chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi khi chúng
được cắt thành những lát mỏng cỡ micromet để cho ánh sáng đi qua. Khi đó
ta mới quan sát được chi tiết của tế bào, hình dạng hay cách sắp xếp của
chúng. Cố định mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho các thành phần của chúng
được bất động ở trạng thái tĩnh. Nếu đem cắt ngay thành các lát cắt mỏng,
mối liên quan giữa các tế bào cũng như cấu trúc mô bị biến đổi, thậm chí bị
đảo lộn do tác động cơ học. Muốn vậy người ta phải tạo khuôn cho bệnh
phẩm, nghĩa là phải làm cho một chất nào đó ngấm sâu vào tế bào hoặc mô
mà khi cắt không làm biến dạng cấu trúc của chúng.
Có nhiều chất được dùng cho phương pháp này nhưng chất hay được
dùng hơn cả là parafin. Hiện có nhiều loại parafin với các điểm nóng chảy
khác nhau nhưng loại thích hợp nhất dùng trong kỹ thuật mô học là parafin có
nhiệt độ nóng chảy từ 56 - 58
o
C. Nếu dùng nhiệt độ nóng chảy của parafin
cao hơn bắt buộc người ta phải chỉnh nhiệt độ của tủ parafin lên nữa, hậu quả
làm cho bệnh phẩm chín, khó cắt và bắt mầu tồi. Ngoài ra, parafin còn được
pha thêm một số chất phụ gia để làm tăng chất lượng của nó như: histoplas,
paraplas… Song parafin không tan trong nước (bệnh phẩm lại có nhiều nước)
và cồn nên bệnh phẩm phải được khử nước bằng cồn có nồng độ thấp (80
o
)
8

Parafin III - 1 giờ
 Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày từ 5 mm đến dưới 8 mm
Cồn 80
o
- 2 giờ
Cồn 90
o
- 6 giờ
Cồn 95
o
- 8 giờ
Cồn 100
o
I - 4 giờ
9
Cồn 100
o
II - 6 giờ
Cồn 100
o
III - 8 giờ
Xylen I - 4 giờ
Xylen II - 8 giờ
Xylen III - 10 giờ
Parafin I - 4 giờ
Parafin II - 6 giờ
Parafin III - 10 giờ
1.3.5. Quy trình chuyển máy:
 Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ
Thời gian cố định tối thiểu là 3 giờ.

10
6) Parafin hút chân không 1 giờ
7) Đúc bloc
1.3.6. Đúc bloc
Bệnh phẩm sau khi qua quá trình đúc bloc đạt yêu cầu thì có thể giữ vô
thời hạn. Muốn đúc bloc phải làm cho parafin ở xung quanh cũng như ở bên
trong bệnh phẩm đặc lại một cách thuần nhất. Để đạt được điều này, người ta
dùng những khuôn bằng kim loại để trao đổi nhiệt diễn ra nhanh chóng và
nước lạnh có đá. Đúc bệnh phẩm phải thao tác sao cho nhiệt độ của parafin và
bệnh phẩm không chênh lệch nhiều. Nếu parafin hay bệnh phẩm nguội quá sẽ
tạo ra một viền trắng xung quanh bệnh phẩm, khi bloc nguội hay cắt bệnh phẩm
có thể bật bloc. Trên thực tế người ta đổ vào khuôn hay thanh chắn kim loại
parafin lỏng đã lọc từ trước, nhúng ngay bệnh phẩm vào parafin đang lỏng này.
Dùng kẹp hơ nóng để định hướng bệnh phẩm theo ý muốn (rất cần phải lưu ý
khâu này, nếu đặt bệnh phẩm không đúng mặt thì sẽ không chuẩn đoán được).
Người ta chọn mặt phẳng cắt là mặt đáy. Với các bệnh phẩm quá nhỏ, có thể
dùng kính lúp để nhặt và đặt bệnh phẩm hoặc nhuộm bệnh phẩm với Eosin 1%
cho dễ nhận.
1.3.7. Kỹ thuật cắt và dán mảnh
Nếu bệnh phẩm đã được xử lý tốt ở các khâu: cố định, pha và vùi thì sẽ
tạo điều kiện cho việc cắt mảnh được dễ dàng hơn.
Trước khi cắt thì máy cắt cần được kiểm tra cả ốc vít và tra dầu bôi trơn.
Nhiệt độ trong phòng cắt không quá 25
o
C và tốt hơn là cắt trong phòng có
điều hòa. Nếu không có điều kiện thì bloc phải được ngâm và nước đá để đảm
bảo đủ độ cứng mới cắt mảnh được. Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và máy cắt
thích hợp là 45
o
. Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàn tiêu

Thuốc nhuộm bào tương: Eosin
12
Với Eosin bán cùng Hematoxylin được pha như sau:
- Một lọ Eosin hòa tan trong 1 lít nước cất 2 lần.
- Lắc cho tan hết.
- Lọc trước khi nhuộm.
1.3.8.2 Nguyên tắc:
Đây là phương pháp nhuộm phối hợp thông dụng nhất bằng cách nhuộm
kế tiếp một phẩm nhuộm nhân “bazơ” - hematin và một phẩm nhuộm bào
tương “acid” - eosin.
Việc nhuộm nhân được nhuộm “tăng dần”người ta dùng lại khi những cấu
trúc của nhân rõ nét nhất. Ngược lại việc nhuộm bào tương“giảm dần” bằng
cách nhuộm sẫm lên rồi loại phẩm thừa bằng cồn có nồng độ thấp.
1.3.8.3. Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant).
- Tiêu bản tẩy nến 3 lần Xylen x 2 lần/ phút.
- Chuyển vào cồn 100
o
, cồn 90
o
, cồn 80
o
x 2 phút mỗi bể.
- Rửa nước chảy 5 phút.
- Nhuộm nhân trong dung dịch Hematoxylin nhanh từ 5 - 7 phút.
- Rửa nước chảy 5 phút.
- Biệt hóa trong cồn acid (acid HCL 0.5% trong cồn 70
o
) vài giây.
- Rửa nước chảy ít nhất 5 phút (kiểm tra dưới kính hiển vi xem nhân
nhuộm đã được chưa. Nếu nhạt quá thì nhuộm thêm, ngược lại nếu sẫm

bn hon thin.
1.2. Phng phỏp nghiờn cu
1.2.1. Thit k nghiờn cu: Mụ t ct ngang cú phõn tớch kt hp hi
cu.
1.2.2. Ni thc hin ti
Labo B mụn gii phu bnh,
13 Lờ Thỏnh Tụng, Hon Kim, H Ni:
L ni phỏt trin cỏc k nng v thnh tho mt chui quy trỡnh
chuyn, ỳc, ct, nhum t bnh phm ra nhng tiờu bn nhum HE
Labo Gii phu bnh vin Lao Phi Trung ng,
463 Hong Hoa Thỏm, Ba ỡnh, H Ni.
15
• Labo Giải phẫu bệnh Bệnh viện K2,
Làng Tựu, xã Tam Hiệp, Thanh trì, Hà Nội.
• Labo Giải phẫu bệnh Bệnh viện 108,
Số 1 Trần Hưng Đạo, Hai Bà Trưng, Hà Nội.
1.2.3. Phương tiện nghiên cứu:
• Kính hiển vi quang học
1.2.4. Quy trình nghiên cứu
• Làm thuần thục kỹ thuật tại bộ môn.
• Đến các cơ sở
o Quan sát, ghi chép
o Theo dõi quy trình kỹ thuật vi thể nhuộm H – E do kỹ thuật viên
tại cơ sở tiến hành.
o Phát hiện các lỗi hay gặp ở các cơ sở
• Đối chiếu lỗi với quy trình làm để phát hiện ra lỗi xảy ra ở khâu nào.
• Đối chiếu tiêu bản có lỗi với tiêu bản cùng lô thực hiện để phát hiện
nguyên nhân gây ra lỗi.
1.2.5. Nhận định kết quả
• Các tiêu bản được nhận định trên kính hiển vi quang học ở các độ