Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 1 -
LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề
Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công
nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ
Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau,
là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuấ
t ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết
trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng
năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn
với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phả
n ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã
cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá
thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động x
ấu tới
môi trường.
II. Lý do chọn đề tài
Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi
khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu
nhiều. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng
dụng rộng rãi ở qui mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả
khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải
quyết các mục đích đề ra.
Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 3 -
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT
1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào
1.1.1. Định nghĩa
Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh
tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa)
các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho
quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Vì thực tế bên ngoài môi trường xung quanh,
các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các
hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên c
ần có các
enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các
hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào. Các enzyme được
tổng hợp và tham gia các phản ứng ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ
có ở vi sinh vật.
1.1.2. Phân loại
Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các
1
– R
2
+H
2
O R
1
OH + R
2
H
Ví dụ: Tinh bột + H
2
O Dextrin + Maltose + Glucose
Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme:
amylase, cellulase, protease và pectinase…
1.1.3. Đặc điểm - tính chất
Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một
enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa:
• Về bản chất enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của
một protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do
phân tử lượng lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào .
• Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do
có nhóm -COOH và -NH
2
trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid
chúng sẽ bị phân ly như sau:
Protein -COOH Protein -COO- + H
+
enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110
o
C như: α-amylase từ vi khuẩn ưa
nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt
độ 110
o
C. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt còn có
khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH
kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi
khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid
2,1…
• Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương
đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme.
Trong trung tâm hoạt độ
ng của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme
(trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease,
cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim
loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca
2+
.
• Là những enzyme chuyên biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ
đặc hiệu với cơ chất.
• Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui
luật cảm ứng cơ chất. Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích
thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn sử dụng
được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích
thước nhỏ hơn để
có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế
bào. Như vậy, khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO
2
, H
2
O,
một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản
phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau.
• Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra
ở ngoài tế bào.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 7 -
• Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi
đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi
hỏi năng lượng rất lớn.
Ví dụ: Trong quá trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose
− Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân
tử gam.
− Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử
gam.
Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose
− Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000
cal/phân tử gam.
Ph
ương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose
• Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen
quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một
hoặc một số phản ứng sinh hóa.
thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công
nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất.
1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật
Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng.
Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và
ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp.
1.2.1. Enzyme amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân
tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH OH – RH + R’OH
Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme
nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (α-
dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới
h
ạn và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của
chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay γ-
amylase). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide.
Amylase
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 9 -
1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan
a enzyme từ
Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0.
Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60
-70
o
C, nhưng cũng có thể tới 80 - 90
o
C đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt.
α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Trong mỗi phân tử α-
amylase đều có chứa 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6
nguyên tử gam Ca/mol. Ca
2+
tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc
3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca
2+
còn
có vai trò duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các
tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 10 -
α-amylase bị loại bỏ hết Ca
2+
thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân
cơ chất. Theo Wallerstein (1969), các ion Ca
2+
có tác dụng ổn định hoạt tính của
α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp. Với nồng độ ion Ca
2+
0,1
, Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
,
Co
2+
và Sn
2+
không ảnh hưởng lắm đến α-amylase. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của α-amylase
Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn
khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên
kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc
glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 11 -
Giai đoạn dextrin hóa
Giai đoạn đường hóa
Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen
Maltotetrose, maltotriose và maltose
chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với
tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 12 -
cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở
chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản
phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có
dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường
α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không
cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là
tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm
nhanh độ nhớt của tinh bột. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là
amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân
tinh bột của enzyme α-amylase:
• Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
• Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra Trimaltose Di & monosaccharide
Amylose Oligosacharide Poliglucose
Maltose Maltotriose Maltotetrose
1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4 glucan-
maltohydrolase)
Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng. Nhiều nhà khoa
học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt
động của β-amylase. Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C
1
của
glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal. Ester này tiếp đó
sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải
amylase thủy phân hoàn toàn amylose, ngược lại nó chỉ thủy phân được 54 - 58%
amylopectin thành β-amylose. Phần amylopectin còn lạ
i là một β-dextrin giới hạn
có khối lượng phân tử cao và có chứa toàn bộ các liên kết α-1,6 của phân tử ban
đầu. Quá trình này xảy ra ở phần thẳng của mạch và dừng lại ở vị trí phân nhánh.
• Enzyme β-amylase có thể thủy phân lần lượt nhiều liên kết
glucoside của cùng một chuỗi trước khi được giải phóng trở lại vào môi trường.
Số lần tác dụng trên một chuỗi α-glucan phụ thu
ộc vào chiều dài của chuỗi,
thường là 4 lần đối với chuỗi ngắn và nhiều lần đối với chuỗi dài.
• Theo phương pháp sản xuất truyền thống β-amylase được thu nhận
từ malt, tuy nhiên ở các nước phương Đông nó có thể được thu nhận từ đậu
tương hoặc khoai lang. Các loại thực vật nói trên không chỉ chứa β-amylase mà
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 14 -
còn chứa cả α-amylase. Điều kiện thích hợp của β-amylase malt đại mạch là 60 -
65
o
C, pH 5,4 - 5,6 (trong dung dịch tinh bột). Vùng pH thích hợp cho β-amylase
hoạt động hẹp hơn so với α-amylase. Trước đây, β-amylase được coi là nguồn
enzyme chỉ có trong hệ thực vật. Ngày nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra loại enzyme này và ứng dụng vào sản xuất.
Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp β-amylase là Bacillus circulans,
Bacillus polymyxa, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces sp. và
Pseudomonas. Đặc biệt là Bacillus cereus
và mycoides có thể đồng thời tạo ra cả
pullulanase.
1.2.1.3. Đặc tính và cơ chế xúc tác của glucoamylase (α-1,4 glucan-
glucohydrolase)
đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katitara
và Kurushima, 1966). Sau đó nó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus
niger, Aspergillus oryzae rồi ở các nhóm vi sinh vật khác. Enzyme này còn có
nhiều tên gọi khác nhau như: amyloglucosidase, taka-amylase Bac, γ-amylse,
matulase,…
Glucoamylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân
polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Khi thủy phân tinh bột cùng
với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài các liên kết α-1,4
và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2
và α-1,3 glucoside (Sawasaki 1960; Ueyama và cộng sự, 1965; Watanabe và
Fukimbara, 1965, 1966).
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose thành glucose (Azarova,
1981; Jerebtxov và Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia và Rodzevits, 1974; Logina
Karpukhina, 1978). Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh như amylopectin,
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 16 -
glucogen, β-dextrin) bị glucoamylase thủy phân với tốc độ khá nhanh. Khi thủy
phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy các
polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các cơ chất phân tử
thấp. Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”. Thể hiện hoạt
lực tối đa ở vùng pH 3,5 - 5,5; nhiệt độ tối ưu là 40 - 60
o
C. So với α-amylase,
glucoamylase bền đối với acid và khi có mặt các oligosaccharide trong môi
trường sẽ làm cho enzyme bền hơn, nhưng kém bền dưới tác dụng của rượu
ethylic, aceton và không được bảo vệ khi có mặt Ca
2+
mà sẽ bị Ca
Glucoamylase kiểu
Rhizopus delemar
Glucoamylase kiểu
Aspergillus niger
khác nhau
oligosaccharide
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 17 -
1.2.1.4. Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase (α-dextrin 6-
glucosidase)
Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen,
pululan và các dextrin. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có
ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α-
1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên
kết này. Do đó pullulan chính là cơ chất lý tưởng của pullulanase, vì nó là một
phân tử không phân nhánh cấu t
ạo bởi những đơn vị maltotriose (có hai liên kết
α-1,4) liên kết với nhau bằng cầu nối α-,6 glucoside.
Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi
các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp
chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng
hiệp đồng của α-amylase và pullulanase làm dextrin này bị thủy phân hoàn toàn.
Pullulanase có pH tối ưu là 5 - 7, nhiệt độ tối ưu là 10 – 50
o
C. Ion Ca
2+
hoạt hóa các enzyme này, trong khi đó các ion Hg
5,1. Theo số liệu của Kirxanov và Pankratov (1969), hoạt tính của enzyme này từ
Rhizopus delemar được bảo vệ ở điều kiện nhiệt độ 30
o
C; pH 5,0 - 6,0 sau 96
giờ. Cũng ở pH này hoạt tính của enzyme này sẽ giảm 15% khi tăng nhiệt độ lên
tới 50
o
C sau 2 giờ.
Hình 1.6. Cấu trúc không gian của oligo-1,6-glucosidase
1.2.1.6. Đặc tính và cơ chế xúc tác của transglucosidase
Ở nhiều loài nấm sợi Aspergillus, enzyme transglucosidase luôn luôn
tương tác với glucoamylase. Transglucosidase có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt
tính thủy phân. Vì thế sự có mặt của transglucosidase trong dung dịch thường
gây nên sự nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase thực hiện
việc chuyển gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và oligosaccharide, xúc tác tạo
thành liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside. Pazur (1961) đã tách được enzyme này từ
Aspergillus niger bằng phương pháp sắc ký hấp phụ trên DEAE - cellulose và
cho biết cơ chế
tác dụng của nó. Transglucosidase không những chỉ thủy phân
maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose; tức là có
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 19 -
khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử
glucose khác nhau bằng liên kết α-1,6 để tạo thành panose hoặc izomaltose.
Rodzevit và Butova (1965) đã tìm thấy trong canh trường nuôi cấy nấm
sợi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và Aspergillus awamori có enzyme
transglucosidase, đồng thời cho biết enzyme này xúc tác sự tổng hợp các
- 20 -
Hình 1.7. Quá trình thủy phân tinh bột dưới sự xúc tác của một số loại
enzyme amylase
1.2.2. Enzyme protease
Nhóm enzyme protease (peptide - hydrolase E.C.3.4) xúc tác quá trình
thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptide
đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Hình 1.8. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân protein
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 21 -
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng
từ vi sinh vật (virus, vi khuẩn và nấm) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệ
t. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
thiol và các chất như: iodine, H
2
O
2
, EDTA… cũng có tác dụng ức chế enzyme
này vì chúng có khả năng gắn với ion kim loại nên thường làm tăng độ bền của
ion kim loại. Protease thiol thường là protease của thực vật như papain,
bromeline…
• Protease acid: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung
tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Asp hoặc Glu hay
cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptide. Các protease acid
thường hoạt động ở vùng pH acid, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl
ester (DNME) và và có tính đặc hiệu đối với các amino acid có vòng th
ơm hoặc
kỵ nước ở hai phía của liên kết peptide bị thủy phân. Protease acid là các enzyme
và của vi nấm như renin (renet)…
• Protease kim loại (metalloprotease): là những protease trong trung
tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại. Các protease kim loại thường hoạt
động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc amino acid
chứa nhóm (-NH
2
-) của liên kết peptide; chúng có thể tác dụng lên các peptide
chứa nhóm (-NH-) của các amino acid kỵ nước có kích thước hoặc các liên kết
peptide được tạo thành từ các amino acid có phân tử thấp. Các protease kim loại
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 23 -
thường bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA… Protease kim loại
carboxylpeptidase A, collagenase và thermolysin…
Ngoài ra, protease còn được chia thành 3 nhóm dựa vào pH hoạt động của
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm
- 24 -
(1976), protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào.
Chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:
− Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành
các amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc dùng làm nguồn C, S, N,…
giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi của môi trường.
− Sự phân giải các peptide phân tử lượng thấp còn có vai trò loại
trừ tác dụng độc hại của nó đối với tế bào vì một số peptide phân t
ử lượng thấp
có thể là kháng nguyên gây kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật.
− Các protease nội bào có thể tham gia quá trình cải tiến một số
phân tử protein và enzyme. Điều này có ý nghĩa đối với việc hình thành và nảy
mầm của bào tử vi sinh vật.
− Protease nội bào còn có tác dụng phân hủy protein vô dụng,
tổng hợp sai do đột biến hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của
vách tế bào…
1.2.2.2. Cơ chế xúc tác của protease vi sinh vật
a) Cơ chất tác dụng
• Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein, chúng
phân giải các liên kết peptide và sản phẩm tạo thành cuối cùng là các acid amin.
Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng và đậu tương…
Bảng 1.1. Một số nguồn thực phẩm giàu protein
Nguồn protein Hàm lượng (%) Nguồn protein Hàm lượng (%)
Thịt bò 20 Thịt gà 23,3
Thịt lợn 29 Cá 16 - 17
Đậu tương 34 Trứng gà 12
(tổng hợp từ nguồn internet)
: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới
được tạo thành).
P
2
: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do
được tạo thành).
1.2.3. Enzyme pectinase
Enzyme pectinase là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân các
polymer pectin thành các hợp phần khác nhau như: galacturonic, arabinose,
methanol... Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.
Những enzyme này có vai trò rất quan trọng trong việc bảo quản trái cây và rau
quả. Enzyme pectinase còn được ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm,
đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme
pectinase cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm.
1.2.3.1. Đặc điểm và tính chất của pectinase vi sinh vật
Trong hệ enzyme pectinase phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzyme
khác nhau, chúng có khối lượng phân tử khoảng 40.400 Da. Pectinase cũng như
các enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc
tác đặc hiệu cơ chất cao.
Copyright: Tài liệu đại học ©